本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種用于檢測(cè)8-ohdg的適配體功能化磁納米材料及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8-ohdg)是一種dna氧化損傷產(chǎn)生的加合物，也是靈敏和有效示蹤dna氧化損傷的有效生物標(biāo)記物。其是指在受到化學(xué)物質(zhì)、電離輻射、吸煙以及空氣污染等因素的影響下，體內(nèi)產(chǎn)生的大量活性氧自由基，致使氧化損傷產(chǎn)生的氧化加合物，若該損傷未被及時(shí)修復(fù)或被錯(cuò)誤修復(fù)時(shí)，即會(huì)引起基因突變，而此突變?nèi)舭l(fā)生在功能基團(tuán)的表達(dá)序列，將會(huì)導(dǎo)致腫瘤等疾病的發(fā)生。因此，dna氧化加合物的形成代表著化學(xué)致癌過程中的一個(gè)早期的、可檢測(cè)的關(guān)鍵階段。在已發(fā)現(xiàn)的二十幾種dna氧化損傷產(chǎn)物中，8-ohdg性能穩(wěn)定，不受飲食等因素影響，可從體液如血漿和尿樣中檢出，可實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)傷性檢測(cè)。為此，8-ohdg已被公認(rèn)為氧化損傷的一種主要生物標(biāo)記物。但是由于尿樣中8-ohdg含量非常低、基質(zhì)干擾很大，分析中常用固相萃取進(jìn)行樣品富集，萃取材料主要有c18和hlb等通用型非選擇性材料，在處理尿樣時(shí)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，缺乏選擇性，嚴(yán)重干擾了含量很低8-ohdg分離分析。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種用于檢測(cè)8-ohdg的適配體功能化磁納米材料，其特異性好，靈敏度高，可克服固相萃取及材料的不足。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種基于適配體功能化磁納米材料富集分離8-ohdg的方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明為了彌補(bǔ)現(xiàn)有富集技術(shù)不足，提供了一種用于檢測(cè)8-ohdg的適配體功能化磁納米材料，其由生物素化8-ohdg適配體修飾到磁納米顆粒表面得到；

所述8-ohdg適配體的序列如seqidno:1所示。

核酸適配體(aptamer)是一種單鏈的寡核苷酸，多為單鏈dna，長(zhǎng)度在10～100bp之間，通常是利用特異的靶標(biāo)從隨機(jī)序列的寡核苷酸文庫(kù)中通過體外篩選獲得，作為一種新型生物識(shí)別分子，可以與靶標(biāo)物質(zhì)高親和力特異性結(jié)合。

本發(fā)明涉及的核酸適配體是已知并成功從體外合成的隨機(jī)寡核甘酸文庫(kù)中通過指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選得到的與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的一簇dna片段(序列如seqidno:1所示)。該適配體的親和力(平衡解離常數(shù)kd)為0.1mmol/l。利用8-ohdg核酸適配體特異性和磁納米材料易分離性可以快速和選擇性從尿液中提取出8-ohdg，克服了固相萃取及材料的不足。

本發(fā)明提供的用于檢測(cè)8-ohdg的適配體功能化磁納米材料可特異性地與8-ohdg結(jié)合，還具有靈敏度高、線性范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，并且磁納米顆粒在進(jìn)行純化的時(shí)候操作簡(jiǎn)單，利用推廣使用。

優(yōu)選的，如上所述的適配體功能化磁納米材料，所述磁納米顆粒是通過戊二醛交聯(lián)作用在氨基化三氧化二鐵表面修飾醛基，再將親和素修飾到磁納米表面得到。

優(yōu)選的，如上所述的適配體功能化磁納米材料，所述生物素化8-ohdg適配體修飾到磁納米顆粒表面的過程具體包括：

將所述磁納米顆粒于pbs中超聲分散，加入生物素化8-ohdg適配體單鏈并孵育，磁分離后，清洗除去未與所述磁納米顆粒連接的單鏈。

一種基于如上所述的適配體功能化磁納米材料的檢測(cè)8-ohdg的方法，包括：

將所述適配體功能化磁納米材料加入到待檢樣品的溶液中，室溫孵育使其充分結(jié)合后用磁鐵分離并洗脫得到洗脫液；通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)洗脫液進(jìn)行檢測(cè)。

優(yōu)選的，如上所述的方法，洗脫時(shí)所用的溶劑為甲醇。

優(yōu)選的，如上所述的方法，洗脫溫度為58℃～62℃，洗脫時(shí)間為50min～70min；

更優(yōu)選的，洗脫溫度為59℃～61℃，洗脫時(shí)間為59min～61min。

優(yōu)選的，如上所述的方法，在通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)洗脫液進(jìn)行檢測(cè)之前還包括：將所述洗脫液吹至近干并用水重懸。

優(yōu)選的，如上所述的方法，液相色譜的流動(dòng)相為0.08％～0.12％v/v甲酸甲醇溶液；更優(yōu)選的，液相色譜的流動(dòng)相為0.1％v/v甲酸甲醇溶液。

優(yōu)選的，如上所述的方法，液相色譜的洗脫方式為梯度洗脫；流速為0.2～0.4ml/min；

更優(yōu)選的，流速為0.3ml/min。

優(yōu)選的，如上所述的方法，質(zhì)譜條件為正離子模式下多反應(yīng)檢測(cè)，檢測(cè)離子對(duì)分別為m/z284.1>140和m/z284.1>168。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

(1)本發(fā)明提供的檢測(cè)探針靈敏度高、選擇性好。

(2)目標(biāo)物能夠在很快的時(shí)間之內(nèi)進(jìn)行富集、分離。

(3)本發(fā)明方法簡(jiǎn)單、快速、易操作。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種適配體功能化磁納米材料磁分離8-羥基脫氧鳥苷的方法，其特征在于：適配體功能化的磁納米材料合成、納米材料吸附8-羥基脫氧鳥苷，并洗脫后通過高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)；

適配體功能化的磁納米材料合成步驟為：

在乙二醇中，按1,6-己二胺、無(wú)水乙酸鈉和六水合三氯化鐵按一定比例混合轉(zhuǎn)移到水熱反應(yīng)釜加熱反應(yīng)，制備出氨基化磁納米粒子。通過戊二醛偶聯(lián)鏈親和素，使磁納米粒子表面修飾上親和素。通過親和素-生物素系統(tǒng)，5末端修飾上生物素的8-羥基脫氧鳥苷適配體固定親和素修飾的磁納米材料表面。

在使用適配體吸附樣品中的目標(biāo)物的時(shí)候，將所述適配體功能化磁納米材料加入到待檢樣品的溶液中，室溫孵育使其充分結(jié)合后用磁鐵分離并洗脫得到洗脫液；通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)洗脫液進(jìn)行檢測(cè)。

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了一種基于適配體功能化磁納米材料富集分離8-ohdg，從而實(shí)現(xiàn)尿液中8-ohdg含量測(cè)定。

s11、適配體功能化的磁納米材料合成

在70ml乙二醇中，加入12.0g1,6-己二胺、4.5g無(wú)水醋酸鈉和2.5g六水合三氯化鐵。然后在50℃加熱條件下攪拌，形成較均勻的膠體溶液。將所得溶液轉(zhuǎn)移到100ml帶聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，在200℃件下反應(yīng)6h。取出反應(yīng)釜后，在室溫下自然冷卻，棄釜內(nèi)上層液體，下層黑色固體用二次水沖洗至燒杯中，然后利用磁分離收集。超聲條件下，再用二次水和乙醇洗滌3-4次，所得黑色固體冷凍干燥。

稱取上述黑色固體4.0mg溶解在2.0ml10.0mmol/lpbs中超聲分散，加入1.0ml15％戊二醛溶液。將混合溶液在室溫下緩慢搖晃2h，反應(yīng)結(jié)束后，磁分離,得到的固體粉末用5.0ml10.0mmol/lpbs洗三次。將粉末再用2.0ml10.0mmol/lpbs溶解，超聲分散開，加入0.5ml1.0mg/ml親和素。此溶液在室溫下緩慢搖晃12h，反應(yīng)結(jié)束后清洗多次，棄上清。所得沉淀物在37℃條件下干燥12h。

利用通過親和素與生物素之間的特異性結(jié)合將表面修飾有親和素的磁性納米球與生物素修飾的8-ohdg適配體單鏈連接。具體方法為取2mg上述沉淀物溶孵于1.0ml10.0mmol/lpbs中超聲分散，隨后加入50nm生物素修飾適配體單鏈，37℃孵育過夜，磁分離后，棄上清，并且用pbs緩沖液清洗多次以保證去除未與納米材料連接的單鏈，最后將沉淀重懸于1mlpbs緩沖液中，4℃保存。

s12、適配體吸附尿液中目標(biāo)物

200l溶于pbs緩沖液的磁納米探針置于2.0ml離心管中，加入1.0ml含1.0ng/ml-10.0ng/ml8-羥基脫氧鳥苷樣品溶液中，室溫下孵育2小時(shí)，磁鐵分離；

s13、目標(biāo)物的解吸

將上述經(jīng)過磁分離后的適配體功能化磁納米粒子于2.0ml甲醇溶劑中在60℃下洗脫1小時(shí)，收集洗脫液，洗脫液吹至近干，用水定容1.0ml；

s14、目標(biāo)物檢測(cè)

將(3)中定容液通過高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)：液相色譜條件為：流動(dòng)相為0.1％甲酸水溶液-甲醇，梯度洗脫；流速為0.3ml/min；質(zhì)譜條件為正離子模式下多反應(yīng)檢測(cè)，檢測(cè)離子對(duì)分別為m/z284.1>140和m/z284.1>168。8-ohdg在0.2ng/ml-20.0ng/ml峰面積與濃度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供了一種基于適配體功能化磁納米材料富集分離8-ohdg，從而實(shí)現(xiàn)尿液中8-ohdg含量測(cè)定。

s21、s22操作同s11、s12。

s23、目標(biāo)物的解吸

將上述經(jīng)過磁分離后的適配體功能化磁納米粒子于2.0ml甲醇溶劑中在58℃下洗脫50min，收集洗脫液，洗脫液吹至近干，用水定容1.0ml；

s24、目標(biāo)物檢測(cè)

將(3)中定容液通過高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)：液相色譜條件為：流動(dòng)相為0.08％甲酸水溶液-甲醇，梯度洗脫；流速為0.4ml/min；質(zhì)譜條件為正離子模式下多反應(yīng)檢測(cè)，檢測(cè)離子對(duì)分別為m/z284.1>140和m/z284.1>168。8-ohdg在0.2ng/ml-20.0ng/ml峰面積與濃度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供了一種基于適配體功能化磁納米材料富集分離8-ohdg，從而實(shí)現(xiàn)尿液中8-ohdg含量測(cè)定。

s31、s32操作同s11、s12。

s33、目標(biāo)物的解吸

將上述經(jīng)過磁分離后的適配體功能化磁納米粒子于2.0ml甲醇溶劑中在62℃下洗脫70min，收集洗脫液，洗脫液吹至近干，用水定容1.0ml；

s34、目標(biāo)物檢測(cè)

將(3)中定容液通過高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)：液相色譜條件為：流動(dòng)相為0.08％甲酸水溶液-甲醇，梯度洗脫；流速為0.2ml/min；質(zhì)譜條件為正離子模式下多反應(yīng)檢測(cè)，檢測(cè)離子對(duì)分別為m/z284.1>140和m/z284.1>168。8-ohdg在0.2ng/ml-20.0ng/ml峰面積與濃度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999。

實(shí)驗(yàn)例1尿樣實(shí)際樣品中8-ohdg含量檢測(cè)及以hlb為固相萃取柱的結(jié)果對(duì)比

取不同志愿者的尿樣，利用實(shí)施例1中的方法和固相萃取分別測(cè)定其中8-ohdg的含量，結(jié)果見表1。將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性比較，結(jié)果表明兩者無(wú)顯著差異。說明該發(fā)明方法快速可靠，靈敏度高，穩(wěn)定性好，適合用于尿樣實(shí)際樣品中8-ohdg的檢測(cè)。

表1尿樣實(shí)際樣品檢測(cè)本方法和固相萃取方法

實(shí)驗(yàn)例2尿樣實(shí)際樣品中8-ohdg含量檢測(cè)及添加回收率試驗(yàn)

從實(shí)驗(yàn)例1得到8-ohdg含量數(shù)據(jù)中選擇一組作為本底值，接著選取添加2.0ng/ml、4.0ng/ml和8.0ng/ml分別添加到待測(cè)物中，同樣利用本發(fā)明方法再次檢測(cè)其中的含量，得到檢測(cè)值?；厥章试?0％～100％之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差少于10％，說明本發(fā)明穩(wěn)定，靈敏，準(zhǔn)確，適合用于尿樣實(shí)際樣品中8-ohdg含量的檢測(cè)(結(jié)果見表2)。

表2制備的適配體功能化磁納米粒子用于尿樣中8-ohdg添加回收率和重復(fù)性

最后應(yīng)說明的是：以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。

sequencelisting

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所

<120>pa1404126bj_用于檢測(cè)8-ohdg的適配體功能化磁納米材料及其應(yīng)用

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