本發(fā)明屬于生物制品領(lǐng)域，具體涉及庫爾勒香梨腐爛病菌毒素的制備方法。

背景技術(shù)：

庫爾勒香梨屬新疆梨種(pyrussinkiangensisyu)，維吾爾語名乃西米提或乃西普提，原產(chǎn)于新疆南疆巴音郭楞蒙古自治州，阿克蘇等地，至今已有1300年的栽培歷史。庫爾勒香梨皮薄肉脆,清甜爽口,細嫩多汁,維生素c含量豐富且耐貯藏，曾多次在國內(nèi)獲獎,在國際市場上被譽為“中華蜜梨”、“梨中珍品”、“果中王子”等稱號。庫爾勒香梨營養(yǎng)價值高，含糖、氨基酸、維生素、各種碳水化合物達14％，水汁為86％。其中含糖量10％，酸0.03％，灰分0.12％，每100克香梨含維生素c約4.3毫克，含有葡萄糖、果酸及多種微量元素，可食部分達83.6％。庫爾勒香梨不僅可以生食，而且可以做梨酒、梨膏等相關(guān)食品，并有"潤肺、涼心、消痰、消炎、止咳、解瘡毒酒毒"等醫(yī)療作用，維吾爾醫(yī)、蒙醫(yī)中常把它作為食療佳品。

庫爾勒香梨在新疆大面積種植，在巴州庫爾勒市種植面積最多，從2007年起，香梨成為庫爾勒市農(nóng)民增收的第一產(chǎn)業(yè)，并且?guī)鞝柪障憷娴姆N植面積以每年5萬畝的速度快速遞增?，F(xiàn)在，庫爾勒香梨已遠銷美國、加拿大、澳大利亞、歐盟、東南亞等十多個國家和地區(qū)。

但近幾年香梨腐爛病發(fā)生嚴重，病情難以控制。腐爛病亦稱腐朽病(decay)，果樹腐爛病又稱爛皮病、臭皮病等，世界各地均有發(fā)生。梨樹腐爛病是梨樹最重要的枝干病害，以侵染和為害主枝和較大的側(cè)生枝組為主，在主干上也有發(fā)生。當病斑環(huán)繞整個主枝時，主枝即死亡，嚴重發(fā)生時可造成死樹和毀園，對果農(nóng)造成巨大的經(jīng)濟損失。

腐爛病菌毒素對庫爾勒香梨具有毒害作用，但對腐爛病菌毒素的研究，可以促進香梨腐爛病的病理性研究，并且可以進一步的奠定研究香梨腐爛病治病機制及防治的基礎(chǔ)，對研究香梨腐爛病治病機制及防治有重要理論意義。因此在研究過程中，需要病菌毒素，但是現(xiàn)在前人的研究只確定了引起庫爾勒香梨樹腐爛病菌為梨幹腐爛殼蕉孢菌(c.carphospermafr.)。目前關(guān)于庫爾勒香梨腐爛病的研究主要在庫爾勒香梨腐爛病病原鑒定和庫爾勒香梨腐爛病菌生物學(xué)特性與致病性方面，只知庫爾勒香梨樹腐爛病菌的最適溫區(qū)為20-30℃，最適ph值為5-7，在全光照的條件下產(chǎn)孢最多且菌絲最密，但是毒素含量非常低；有關(guān)庫爾勒香梨腐爛病菌產(chǎn)毒條件研究未見報道，無法確定最適產(chǎn)毒培養(yǎng)方法。因為不同病原菌最適產(chǎn)毒培養(yǎng)條件也有所不同，例如：番茄葉霉病菌產(chǎn)毒最適培養(yǎng)條件：ph為6、溫度為26-30℃、培養(yǎng)時間21天、黑暗條件下振蕩培養(yǎng)；雷公藤角斑病菌產(chǎn)毒最適培養(yǎng)條件：ph為7的查氏培養(yǎng)液中，培養(yǎng)溫度為29℃，黑暗條件下振蕩培養(yǎng)25天產(chǎn)生的毒素致病力最強。從而香梨腐爛病菌的毒素很難快速有效的制備出來，限制了香梨腐爛病的研究。

有鑒于此，本發(fā)明提出一種庫爾勒香梨腐爛病菌毒素的制備方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種庫爾勒香梨腐爛病菌毒素的制備方法，該制備方法簡單，并且可以有效的制備出庫爾勒香梨腐爛病菌毒素。

為了實現(xiàn)上述目的，所采用的的技術(shù)方案為：

庫爾勒香梨腐爛病菌毒素的制備方法，包括以下步驟：

(1)將活化后的庫爾勒香梨腐爛病菌接種到培養(yǎng)液中，在20-30℃下振蕩培養(yǎng)3天以上，得培養(yǎng)后的菌液；

所述培養(yǎng)液為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液、查氏培養(yǎng)液和葉片煎汁蔗糖培養(yǎng)液中的一種；

(2)將培養(yǎng)后的菌液濾去菌絲，再過濾，得濾液；將濾液離心15-21分鐘，收集上清液；將上清液萃取，濃縮，得到香梨腐爛病菌毒素。

進一步的，所述馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液的制備：將去皮馬鈴薯切塊，加水煮沸15-30分鐘，過濾，得馬鈴薯濾液；向馬鈴薯濾液中加入葡萄糖，并且加水定容，再滅菌，得馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液；其中，馬鈴薯的質(zhì)量、葡萄糖的質(zhì)量與定容后的體積比為20g：2g：95-105ml；

所述馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液的制備：將去皮馬鈴薯切塊，加水煮沸15-30分鐘，過濾，得馬鈴薯濾液；向馬鈴薯濾液中加入蔗糖，并且加水定容，再滅菌，得馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液；其中，馬鈴薯的質(zhì)量、蔗糖的質(zhì)量與定容后的體積比為20g：2g：95-105ml；

所述查氏培養(yǎng)液中的含氮化合物、磷酸氫二鉀、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、蔗糖和水的質(zhì)量比為2:1:0.5:0.5:0.01:30:950-1050；

所述香梨葉片煎汁蔗糖培養(yǎng)液的制備：將香梨葉片加水煮沸15-30分鐘，過濾，得濾液；向濾液中加入蔗糖，并且加水定容，再滅菌，得香梨葉片煎汁蔗糖培養(yǎng)液；其中，香梨葉片的質(zhì)量、蔗糖的質(zhì)量與定容后的體積比為6g：2g：95-105ml。

再進一步的，所述查氏培養(yǎng)液中的含氮化合物為硝酸鈉或酵母膏。

進一步的，所述步驟(1)中，所述培養(yǎng)液的ph值為6.0-8.0；

所述庫爾勒香梨腐爛病菌接種后進行暗培養(yǎng)。

再進一步的，所述步驟(1)中，所述培養(yǎng)液的ph值為7.0；

所述振蕩培養(yǎng)為連續(xù)振蕩培養(yǎng)；

所述培養(yǎng)溫度為25℃。

再進一步的，所述步驟(1)中，振蕩的轉(zhuǎn)速為100-140r/min。

再進一步的，所述步驟(1)中，振蕩的轉(zhuǎn)速為120r/min。

進一步的，所述步驟(2)中，離心的轉(zhuǎn)速為4500-5500r/min。

再進一步的，所述步驟(2)中，離心的轉(zhuǎn)速為5000r/min。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明所述的庫爾勒香梨腐爛病菌毒素的制備方法，該制備方法簡單，并且在最適產(chǎn)毒條件下培養(yǎng)庫爾勒香梨腐爛病菌，可以快速有效的制備出庫爾勒香梨腐爛病菌毒素，促進對香梨腐爛病的研究，從而促進香梨腐爛病的病理性研究，還可以促進對香梨腐爛病的防治。

附圖說明

圖1為離體葉片針刺法培養(yǎng)5天后葉片的示意圖；

圖2為葉圓片浸漬法培養(yǎng)5天后濾紙的示意圖；

圖3為不同培養(yǎng)溫度下庫爾勒香梨腐爛病菌壞死斑直徑的折線圖；

圖4為不同ph值下庫爾勒香梨腐爛病菌壞死斑直徑的折線圖；

圖5為不同通氣量下庫爾勒香梨腐爛病菌壞死斑直徑的柱形圖。

具體實施方式

為了進一步闡述本發(fā)明庫爾勒香梨腐爛病菌毒素的制備方法，達到預(yù)期發(fā)明目的，以下結(jié)合較佳實施例，對依據(jù)本發(fā)明提出的庫爾勒香梨腐爛病菌毒素的制備方法，其具體實施方式、結(jié)構(gòu)、特征及其功效，詳細說明如后。在下述說明中，不同的“一實施例”或“實施例”指的不一定是同一實施例。此外，一或多個實施例中的特定特征、結(jié)構(gòu)或特點可由任何合適形式組合。

本發(fā)明實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件書進行。

下面將結(jié)合具體的實施例，對本發(fā)明庫爾勒香梨腐爛病菌毒素的制備方法做進一步的詳細介紹：

一實施例

實施例1.

(1)將活化后的庫爾勒香梨腐爛病菌接種到ph值為6.0的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，置于溫度為20℃，轉(zhuǎn)速為140r/min的搖床中，在全黑暗條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng)5天，得培養(yǎng)后的菌液；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液的制備：將200g去皮馬鈴薯切塊，加水煮沸15分鐘，過濾，得馬鈴薯濾液；向馬鈴薯濾液中加入20g葡萄糖，并且加水定容至950ml，再滅菌，得馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液。

(2)將培養(yǎng)后的菌液先用雙層紗布濾去菌絲，再用含有雙層濾紙的漏斗過濾，得濾液；濾液用離心機離心，轉(zhuǎn)速為4500r/min，時間為21min，上清液即為無菌絲的粗毒素濾液，收集上清液；將上清液萃取，濃縮，得到香梨腐爛病菌毒素。

本發(fā)明實施例所述的庫爾勒香梨腐爛病菌毒素的制備方法，該制備方法簡單，并且在最適產(chǎn)毒條件下培養(yǎng)庫爾勒香梨腐爛病菌，可以快速有效的制備出庫爾勒香梨腐爛病菌毒素，促進對香梨腐爛病的研究，從而促進香梨腐爛病的病理性研究，還可以促進對香梨腐爛病的防治。

實施例2.

(1)將活化后的庫爾勒香梨腐爛病菌接種到ph值為8.0的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，置于溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為100r/min的搖床中，在全黑暗條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng)3天，得培養(yǎng)后的菌液；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液的制備：將200g去皮馬鈴薯切塊，加水煮沸30分鐘，過濾，得馬鈴薯濾液；向馬鈴薯濾液中加入20g葡萄糖，并且加水定容至1050ml，再滅菌，得馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液。

(2)將培養(yǎng)后的菌液先用雙層紗布濾去菌絲，再用含有雙層濾紙的漏斗過濾，得濾液；濾液用離心機離心，轉(zhuǎn)速為5500r/min，時間為15min，上清液即為無菌絲的粗毒素濾液，收集上清液；將上清液萃取，濃縮，得到香梨腐爛病菌毒素。

本發(fā)明實施例所述的庫爾勒香梨腐爛病菌毒素的制備方法，該制備方法簡單，并且在最適產(chǎn)毒條件下培養(yǎng)庫爾勒香梨腐爛病菌，可以快速有效的制備出庫爾勒香梨腐爛病菌毒素，促進對香梨腐爛病的研究，從而促進香梨腐爛病的病理性研究，還可以促進對香梨腐爛病的防治。

實施例3.

(1)將活化后的庫爾勒香梨腐爛病菌接種到ph值為7.0的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，置于溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為120r/min的搖床中，在全黑暗條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng)4天，得培養(yǎng)后的菌液；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液的制備：將200g去皮馬鈴薯切塊，加水煮沸25分鐘，過濾，得馬鈴薯濾液；向馬鈴薯濾液中加入20g葡萄糖，并且加水定容至1000ml，再滅菌，得馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液。

(2)將培養(yǎng)后的菌液先用雙層紗布濾去菌絲，再用含有雙層濾紙的漏斗過濾，得濾液；濾液用離心機離心，轉(zhuǎn)速為5000r/min，時間為18min，上清液即為無菌絲的粗毒素濾液，收集上清液；將上清液萃取，濃縮，得到香梨腐爛病菌毒素。

本發(fā)明實施例所述的庫爾勒香梨腐爛病菌毒素的制備方法，該制備方法簡單，并且在最適產(chǎn)毒條件下培養(yǎng)庫爾勒香梨腐爛病菌，可以快速有效的制備出庫爾勒香梨腐爛病菌毒素，促進對香梨腐爛病的研究，從而促進香梨腐爛病的病理性研究，還可以促進對香梨腐爛病的防治。

實施例4.

(1)將活化后的庫爾勒香梨腐爛病菌接種到ph值為6.0的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液中，置于溫度為23℃，轉(zhuǎn)速為110r/min的搖床中，在全黑暗條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng)3天，得培養(yǎng)后的菌液；馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液的制備：將200g去皮馬鈴薯切塊，加水煮沸20分鐘，過濾，得馬鈴薯濾液；向馬鈴薯濾液中加入20g蔗糖，并且加水定容至950ml，再滅菌，得馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液。

(2)將培養(yǎng)后的菌液先用雙層紗布濾去菌絲，再用含有雙層濾紙的漏斗過濾，得濾液；濾液用離心機離心，轉(zhuǎn)速為4800r/min，時間為19min，上清液即為無菌絲的粗毒素濾液，收集上清液；將上清液萃取，濃縮，得到香梨腐爛病菌毒素。

本發(fā)明實施例所述的庫爾勒香梨腐爛病菌毒素的制備方法，該制備方法簡單，并且在最適產(chǎn)毒條件下培養(yǎng)庫爾勒香梨腐爛病菌，可以快速有效的制備出庫爾勒香梨腐爛病菌毒素，促進對香梨腐爛病的研究，從而促進香梨腐爛病的病理性研究，還可以促進對香梨腐爛病的防治。

實施例5.

(1)將活化后的庫爾勒香梨腐爛病菌接種到ph值為7.0的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液中，置于溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為130r/min的搖床中，在全黑暗條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng)6天，得培養(yǎng)后的菌液；馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液的制備：將200g去皮馬鈴薯切塊，加水煮沸22分鐘，過濾，得馬鈴薯濾液；向馬鈴薯濾液中加入20g蔗糖，并且加水定容至1000ml，再滅菌，得馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液。

(2)將培養(yǎng)后的菌液先用雙層紗布濾去菌絲，再用含有雙層濾紙的漏斗過濾，得濾液；濾液用離心機離心，轉(zhuǎn)速為5100r/min，時間為18min，上清液即為無菌絲的粗毒素濾液，收集上清液；將上清液萃取，濃縮，得到香梨腐爛病菌毒素。

本發(fā)明實施例所述的庫爾勒香梨腐爛病菌毒素的制備方法，該制備方法簡單，并且在最適產(chǎn)毒條件下培養(yǎng)庫爾勒香梨腐爛病菌，可以快速有效的制備出庫爾勒香梨腐爛病菌毒素，促進對香梨腐爛病的研究，從而促進香梨腐爛病的病理性研究，還可以促進對香梨腐爛病的防治。

實施例6.

(1)將活化后的庫爾勒香梨腐爛病菌接種到ph值為8.0的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液中，置于溫度為26℃，轉(zhuǎn)速為125r/min的搖床中，在全黑暗條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng)4天，得培養(yǎng)后的菌液；馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液的制備：將200g去皮馬鈴薯切塊，加水煮沸28分鐘，過濾，得馬鈴薯濾液；向馬鈴薯濾液中加入20g蔗糖，并且加水定容至1050ml，再滅菌，得馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液。

(2)將培養(yǎng)后的菌液先用雙層紗布濾去菌絲，再用含有雙層濾紙的漏斗過濾，得濾液；濾液用離心機離心，轉(zhuǎn)速為5000r/min，時間為20min，上清液即為無菌絲的粗毒素濾液，收集上清液；將上清液萃取，濃縮，得到香梨腐爛病菌毒素。

本發(fā)明實施例所述的庫爾勒香梨腐爛病菌毒素的制備方法，該制備方法簡單，并且在最適產(chǎn)毒條件下培養(yǎng)庫爾勒香梨腐爛病菌，可以快速有效的制備出庫爾勒香梨腐爛病菌毒素，促進對香梨腐爛病的研究，從而促進香梨腐爛病的病理性研究，還可以促進對香梨腐爛病的防治。

實施例7.

(1)將活化后的庫爾勒香梨腐爛病菌接種到ph值為7.0的查氏培養(yǎng)液中，置于溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為120r/min的搖床中，在全黑暗條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng)4天，得培養(yǎng)后的菌液；查氏培養(yǎng)液中含有硝酸鈉2g、磷酸氫二鉀1g、氯化鉀0.5g、硫酸鎂0.5g、硫酸亞鐵0.01g、蔗糖30g和水950g。

(2)將培養(yǎng)后的菌液先用雙層紗布濾去菌絲，再用含有雙層濾紙的漏斗過濾，得濾液；濾液用離心機離心，轉(zhuǎn)速為4500r/min，時間為21min，上清液即為無菌絲的粗毒素濾液，收集上清液；將上清液萃取，濃縮，得到香梨腐爛病菌毒素。

本發(fā)明實施例所述的庫爾勒香梨腐爛病菌毒素的制備方法，該制備方法簡單，并且在最適產(chǎn)毒條件下培養(yǎng)庫爾勒香梨腐爛病菌，可以快速有效的制備出庫爾勒香梨腐爛病菌毒素，促進對香梨腐爛病的研究，從而促進香梨腐爛病的病理性研究，還可以促進對香梨腐爛病的防治。

實施例8.

(1)將活化后的庫爾勒香梨腐爛病菌接種到ph值為7.0的查氏培養(yǎng)液中，置于溫度為23℃，轉(zhuǎn)速為130r/min的搖床中，在全黑暗條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng)5天，得培養(yǎng)后的菌液；查氏培養(yǎng)液中含有酵母膏2g、磷酸氫二鉀1g、氯化鉀0.5g、硫酸鎂0.5g、硫酸亞鐵0.01g、蔗糖30g和水1050g。

(2)將培養(yǎng)后的菌液先用雙層紗布濾去菌絲，再用含有雙層濾紙的漏斗過濾，得濾液；濾液用離心機離心，轉(zhuǎn)速為5500r/min，時間為15min，上清液即為無菌絲的粗毒素濾液，收集上清液；將上清液萃取，濃縮，得到香梨腐爛病菌毒素。

本發(fā)明實施例所述的庫爾勒香梨腐爛病菌毒素的制備方法，該制備方法簡單，并且在最適產(chǎn)毒條件下培養(yǎng)庫爾勒香梨腐爛病菌，可以快速有效的制備出庫爾勒香梨腐爛病菌毒素，促進對香梨腐爛病的研究，從而促進香梨腐爛病的病理性研究，還可以促進對香梨腐爛病的防治。

實施例9.

(1)將活化后的庫爾勒香梨腐爛病菌接種到ph值為7.2的查氏培養(yǎng)液中，置于溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為110r/min的搖床中，在全黑暗條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng)3天，得培養(yǎng)后的菌液；查氏培養(yǎng)液中含有硝酸鈉2g、磷酸氫二鉀1g、氯化鉀0.5g、硫酸鎂0.5g、硫酸亞鐵0.01g、蔗糖30g和水1000g。

(2)將培養(yǎng)后的菌液先用雙層紗布濾去菌絲，再用含有雙層濾紙的漏斗過濾，得濾液；濾液用離心機離心，轉(zhuǎn)速為5200r/min，時間為17min，上清液即為無菌絲的粗毒素濾液，收集上清液；將上清液萃取，濃縮，得到香梨腐爛病菌毒素。

本發(fā)明實施例所述的庫爾勒香梨腐爛病菌毒素的制備方法，該制備方法簡單，并且在最適產(chǎn)毒條件下培養(yǎng)庫爾勒香梨腐爛病菌，可以快速有效的制備出庫爾勒香梨腐爛病菌毒素，促進對腐爛病菌毒素的研究，從而促進香梨腐爛病的病理性研究，還可以促進對香梨腐爛病的防治。

實施例10.

(1)將活化后的庫爾勒香梨腐爛病菌接種到ph值為6.8的香梨葉片煎汁蔗糖培養(yǎng)液中，置于溫度為29℃，轉(zhuǎn)速為115r/min的搖床中，在全黑暗條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng)3天，得培養(yǎng)后的菌液；香梨葉片煎汁蔗糖培養(yǎng)液的制備：將60g的香梨葉片加水煮沸15分鐘，過濾，得香梨葉片濾液；向香梨葉片濾液中加入20g蔗糖，并且加水定容至950ml，再滅菌，得香梨葉片煎汁蔗糖培養(yǎng)液。

(2)將培養(yǎng)后的菌液先用雙層紗布濾去菌絲，再用含有雙層濾紙的漏斗過濾，得濾液；濾液用離心機離心，轉(zhuǎn)速為4700r/min，時間為20min，上清液即為無菌絲的粗毒素濾液，收集上清液；將上清液萃取，濃縮，得到香梨腐爛病菌毒素。

本發(fā)明實施例所述的庫爾勒香梨腐爛病菌毒素的制備方法，該制備方法簡單，并且在最適產(chǎn)毒條件下培養(yǎng)庫爾勒香梨腐爛病菌，可以快速有效的制備出庫爾勒香梨腐爛病菌毒素，促進對香梨腐爛病的研究，從而促進香梨腐爛病的病理性研究，還可以促進對香梨腐爛病的防治。

實施例11.

(1)將活化后的庫爾勒香梨腐爛病菌接種到ph值為7.5的香梨葉片煎汁蔗糖培養(yǎng)液中，置于溫度為26℃，轉(zhuǎn)速為120r/min的搖床中，在全黑暗條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng)5天，得培養(yǎng)后的菌液；香梨葉片煎汁蔗糖培養(yǎng)液：將60g的香梨葉片加水煮沸30分鐘，過濾，得香梨葉片濾液；向香梨葉片濾液中加入20g蔗糖，并且加水定容至1050ml，再滅菌，得香梨葉片煎汁蔗糖培養(yǎng)液。

(2)將培養(yǎng)后的菌液先用雙層紗布濾去菌絲，再用含有雙層濾紙的漏斗過濾，得濾液；濾液用離心機離心，轉(zhuǎn)速為5200r/min，時間為16min，上清液即為無菌絲的粗毒素濾液，收集上清液；將上清液萃取，濃縮，得到香梨腐爛病菌毒素。

本發(fā)明實施例所述的庫爾勒香梨腐爛病菌毒素的制備方法，該制備方法簡單，并且在最適產(chǎn)毒條件下培養(yǎng)庫爾勒香梨腐爛病菌，可以快速有效的制備出庫爾勒香梨腐爛病菌毒素，促進對香梨腐爛病的研究，從而促進香梨腐爛病的病理性研究，還可以促進對香梨腐爛病的防治。

實施例12.

(1)將活化后的庫爾勒香梨腐爛病菌接種到ph值為6.5的香梨葉片煎汁蔗糖培養(yǎng)液中，置于溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為120r/min的搖床中，在全黑暗條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng)4天，得培養(yǎng)后的菌液；香梨葉片煎汁蔗糖培養(yǎng)液：將60g的香梨葉片加水煮沸25分鐘，過濾，得香梨葉片濾液；向香梨葉片濾液中加入20g蔗糖，并且加水定容至1000ml，再滅菌，得香梨葉片煎汁蔗糖培養(yǎng)液。

(2)將培養(yǎng)后的菌液先用雙層紗布濾去菌絲，再用含有雙層濾紙的漏斗過濾，得濾液；濾液用離心機離心，轉(zhuǎn)速為5000r/min，時間為19min，上清液即為無菌絲的粗毒素濾液，收集上清液；將上清液萃取，濃縮，得到香梨腐爛病菌毒素。

本發(fā)明實施例所述的庫爾勒香梨腐爛病菌毒素的制備方法，該制備方法簡單，并且在最適產(chǎn)毒條件下培養(yǎng)庫爾勒香梨腐爛病菌，可以快速有效的制備出庫爾勒香梨腐爛病菌毒素，促進對香梨腐爛病的研究，從而促進香梨腐爛病的病理性研究，還可以促進對香梨腐爛病的防治。

二實驗測試

1材料與方法

1.1供試菌株

在阿拉爾3個不同梨園中采集帶有香梨腐爛病菌的樹皮，經(jīng)柯赫氏法則驗證后獲得純培養(yǎng)備用。對所選菌株進行編號，分別為菌種xl-1、菌種xl-2和菌種xl-3，供試菌株形態(tài)特征如表1所示。

表1供試菌株形態(tài)特征

1.2病菌粗毒素濾液的提取與制備

(1)腐爛病菌的活化：將腐爛病菌接到pda培養(yǎng)基上，25℃下培養(yǎng)5天。

(2)病菌粗毒素濾液的提取與制備：用直徑6mm的圓形打孔器在長勢均勻的菌落邊緣打取菌餅，接種到盛有150ml培養(yǎng)液的三角瓶中，每瓶接5個菌餅。置于溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為120r/min的搖床中暗培養(yǎng)5天。將培養(yǎng)的菌液先用雙層紗布濾去菌絲，再用含有雙層濾紙的漏斗過濾，濾液于離心機5000r/min，18min，上清液即為無菌絲的粗毒素濾液。

1.3生物活性測定

1.3.1離體葉片針刺法：取相同部位的成熟葉片，用清水洗凈，經(jīng)70％的酒精中浸泡3秒,再用無菌水漂洗3次，用滅菌的濾紙吸干葉面水分；在葉面上針刺造成輕微傷口(避開葉脈)，每次吸取20ul粗毒素濾液于針刺部位，設(shè)3次重復(fù)，以滅菌純水對照。處理后葉片置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后測量菌斑大小并記錄，如圖1所示。

1.3.2葉圓片浸漬法：分別吸取2ml不同條件的毒素溶液于培養(yǎng)皿中(含濾紙)。取香梨一定部位的葉片，用清水清洗凈然，經(jīng)70％的酒精中浸泡3秒,再用無菌水漂洗3次，用滅菌的濾紙吸干葉面水分；用圓形打孔器(ф＝8cm)打取圓片，腹面向下平放在加有2ml粗毒素濾液的培養(yǎng)皿中的濾紙上，每皿6片。設(shè)3次重復(fù)，以滅菌純水對照。處理后葉片置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)觀察5天并記錄，如圖2所示。

2.1不同培養(yǎng)條件的試驗設(shè)計

2.1.1不同培養(yǎng)液產(chǎn)毒能力的測定

試驗選用5中培養(yǎng)液，分別為：

(1)馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(簡稱pd培養(yǎng)液)：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000ml。(即實施例3制備的培養(yǎng)液)

(2)馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液(簡稱ps培養(yǎng)液)：馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水1000ml。(即實施例5制備的培養(yǎng)液)

(3)czapek培養(yǎng)液(又名查氏培養(yǎng)液)：nan032g,k2hp041g，kc10.5g，0.5g的mgso4·7h20，0.01g的feso4，蔗糖30g，蒸餾水1000g。(即實施例9制備的培養(yǎng)液)

(4)香梨葉片煎汁蔗糖培養(yǎng)液：香梨葉片60g,蔗糖20g，蒸餾水1000ml。(即實施例12制備的培養(yǎng)液)

(5)香梨葉片煎汁馬鈴薯培養(yǎng)液：香梨葉片60g，馬鈴薯200g，蒸餾水1000ml。

將三種香梨腐爛病菌菌餅分別接入上述5種培養(yǎng)液，各培養(yǎng)液ph值為7。在25℃、光照、轉(zhuǎn)速為120r/min的振蕩條件下培養(yǎng)5天。所有處理均按照1.3的方法提取含毒濾液，1.4的方法進行生物活性測定。測定菌斑直徑，觀察褪綠斑面積大小。

2.1.2不同培養(yǎng)時間對產(chǎn)毒能力的影響

將菌餅接入pd培養(yǎng)液中，在25℃、光照、轉(zhuǎn)速為120r/min的振蕩條件下分別培養(yǎng)1、3、5、7、9天后，測定其產(chǎn)毒量。所有處理均按照1.3的方法提取含毒濾液，1.4的方法進行生物活性測定。測定菌斑直徑，觀察褪綠斑面積大小。

2.1.3不同培養(yǎng)溫度對產(chǎn)毒能力的影響

將菌餅接入pd培養(yǎng)液中，在光照、轉(zhuǎn)速為120r/min的振蕩條件下，分別在10、15、20、25、30℃條件下培養(yǎng)5天后，測定其產(chǎn)毒量。所有處理均按照1.3的方法提取含毒濾液，1.4的方法進行生物活性測定。測定菌斑直徑，觀察褪綠斑面積大小。

2.1.4不同ph值對產(chǎn)毒能力的影響

用稀釋后的hcl和naoh溶液調(diào)節(jié)pd培養(yǎng)液的ph值，分別將ph值調(diào)至1、2、3、4、5、6、7、8、9。將菌餅接入pd培養(yǎng)液中，在25℃、光照、轉(zhuǎn)速為120r/min的振蕩條件下培養(yǎng)5天后，測定其產(chǎn)毒量。所有處理均按照1.3的方法提取含毒濾液，1.4的方法進行生物活性測定。測定菌斑直徑，觀察褪綠斑面積大小。

2.1.5通氣量對產(chǎn)毒能力的影響

將菌餅接入pd培養(yǎng)液中，在25℃、光照條件下，分別靜置培養(yǎng)(不振蕩)、間歇振蕩培養(yǎng)(每天振蕩12h，轉(zhuǎn)速為120r/min)、連續(xù)振蕩培養(yǎng)(全天振蕩，轉(zhuǎn)速為120r/min)，培養(yǎng)5天后，測定其產(chǎn)毒量。所有處理均按照1.3的方法提取含毒濾液，1.4的方法進行生物活性測定。測定菌斑直徑，觀察褪綠斑面積大小。

2.1.6不同光照對產(chǎn)毒能力的影響

將菌餅接入pd培養(yǎng)液中，在25℃、轉(zhuǎn)速為120r/min的振蕩條件下，分別置于全光照、晝夜自然交替、全黑暗條件下培養(yǎng)5天后，測定其產(chǎn)毒量。所有處理均按照1.3的方法提取含毒濾液，1.4的方法進行生物活性測定。測定菌斑直徑，觀察褪綠斑面積大小。

2.3數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用dps和excel軟件進行分析。

3結(jié)果與分析

3.1不同培養(yǎng)液對產(chǎn)毒的影響

由表2可知，供試五種培養(yǎng)液均能使庫爾勒香梨腐爛病菌產(chǎn)毒。菌株xl-1在pd培養(yǎng)液中產(chǎn)毒能力最強,壞死斑直徑2.9mm。xl-2在czapek培養(yǎng)液中產(chǎn)毒能力最強，壞死斑直徑2.8mm.菌株xl-3在ps培養(yǎng)液中產(chǎn)毒能力最強，壞死斑直徑3.9mm。菌株xl-1和xl-2在五種培養(yǎng)液中無顯著差異。菌株xl-3只有葉片煎汁馬鈴薯培養(yǎng)液與其他四種培養(yǎng)液差異顯著，壞死斑直徑1.4mm。菌株xl-1和xl-2在葉片煎汁馬鈴薯培養(yǎng)液中形成壞死斑直徑也較小。說明葉片煎汁馬鈴薯培養(yǎng)液與其它培養(yǎng)液相比不利于香梨腐爛病菌產(chǎn)毒。pd培養(yǎng)液、ps培養(yǎng)液、czapek培養(yǎng)液和葉片煎汁蔗糖培養(yǎng)液均能作為香梨腐爛病菌產(chǎn)毒培養(yǎng)液。

表2不同培養(yǎng)液對庫爾勒香梨腐爛病產(chǎn)毒的影響

注：圖中數(shù)據(jù)為三次重復(fù)的平均值，小寫字母表示差異達0.05顯著水平

2.2不同培養(yǎng)時間對產(chǎn)毒的影響

由表3可知。菌株xl-1在1天的處理中產(chǎn)毒能力最弱，且差異顯著。5天處理中產(chǎn)毒能力最強，壞死斑直徑3.4mm，但3天、5天、7天處理無顯著差異。xl-2在五個處理中均無顯著差異，在7天的處理中產(chǎn)毒能力最弱，5天處理中產(chǎn)毒能力最強。菌株xl-3在1天的處理中產(chǎn)毒能力最弱，且差異顯著。5天處理中產(chǎn)毒能力最強，壞死斑直徑3.4mm。但3天、5天、7天、9天處理無顯著差異。三個菌株在不同培養(yǎng)時間下產(chǎn)毒能力趨勢保持一致，1天到3天的產(chǎn)毒能力上升，3天后，產(chǎn)毒能力趨于平緩。說明1天的處理條件香梨腐爛病菌產(chǎn)毒能力弱，可能由于1天的處理時間太短。1天到3天之間，產(chǎn)毒量增加迅速。3天后，病菌產(chǎn)毒含量達到高峰，基本保持在一個水平。

表3不同培養(yǎng)時間對庫爾勒香梨腐爛病產(chǎn)毒的影響

注：圖中數(shù)據(jù)為三次重復(fù)的平均值，小寫字母表示差異達0.05顯著水平

3.3不同培養(yǎng)溫度對產(chǎn)毒的影響

由表4和圖3可知，溫度對產(chǎn)毒影響較大。三個菌株在五個溫度處理條件下產(chǎn)毒含量差異性保持一致。在溫度低于25℃時，庫爾勒香梨腐爛病菌產(chǎn)毒能力隨溫度的升高而升高。25℃條件下壞死斑直徑最大，且與其他它處理差異顯著。25℃后，庫爾勒香梨腐爛病菌產(chǎn)毒能力下降。20℃與30℃培養(yǎng)條件下壞死斑直徑無顯著差異。說明最適合產(chǎn)毒的培養(yǎng)基溫度為20-30℃，其中25℃是最佳庫爾勒香梨腐爛病菌產(chǎn)毒的條件，溫度過高或過低都影響病菌產(chǎn)毒。

表4不同培養(yǎng)溫度對庫爾勒香梨腐爛病菌產(chǎn)毒的影響

注：圖中數(shù)據(jù)為三次重復(fù)的平均值，小寫字母表示差異達0.05顯著水平

3.4不同ph值對產(chǎn)毒的影響

由表5和圖4可以看出，在ph值1.0-6.0間，三個菌株產(chǎn)毒能力呈上升趨勢。在ph值6.0-8.0間，庫爾勒香梨腐爛病菌產(chǎn)毒能力最強。在ph值8.0-9.0間，產(chǎn)毒能力下降。菌株xl-1和xl-2在ph值5.0-8.0間產(chǎn)毒能力較好，無顯著差異。壞死斑直徑在ph值7.0時達到最大，分別為4.3mm和4.6mm。菌株xl-3在ph值2.0-9.0間，無顯著差異。ph值8.0時，壞死斑直徑最大，達5.9mm。三個菌株在不同ph處理條件下產(chǎn)毒能力的強弱基本一致。說明最適合產(chǎn)毒的培養(yǎng)基ph值為6-8,最佳產(chǎn)毒ph為7。

表5不同ph值對庫爾勒香梨腐爛病菌產(chǎn)毒的影響

注：圖中數(shù)據(jù)為三次重復(fù)的平均值，小寫字母表示差異達0.05顯著水平

3.5通氣量對產(chǎn)毒的影響

由表6和圖5可知，菌株xl-1和菌株xl-3在不同培養(yǎng)方式條件下差異性保持一致。全天振蕩條件下香梨腐爛病菌產(chǎn)毒能力最強，菌株xl-1壞死斑直徑達2.9mm，xl-2壞死斑直徑達3.4mm。但全天振蕩與間歇振蕩培養(yǎng)條件無顯著差異。靜置培養(yǎng)條件下香梨腐爛病菌產(chǎn)毒能力最弱，菌株xl-1壞死斑直徑達0.6mm，xl-2壞死斑直徑達1.7mm。且差異顯著。xl-2在全天振蕩條件下產(chǎn)毒能力最強，在靜置培養(yǎng)條件下產(chǎn)毒能力最弱。但在三個培養(yǎng)方式下的產(chǎn)毒含量無顯著差異，可能由于數(shù)據(jù)過少造成。綜上可得，與靜置培養(yǎng)條件相比，振蕩條件更適合庫爾勒香梨腐爛病菌產(chǎn)毒。

表6通氣量對庫爾勒香梨腐爛病產(chǎn)毒的影響

注：圖中數(shù)據(jù)為三次重復(fù)的平均值，小寫字母表示差異達0.05顯著水平

2.6光照條件對產(chǎn)毒的影響

由表7可知，光照條件對香梨腐爛病菌產(chǎn)毒具有影響。菌株xl-1和菌株xl-3差異性保持一致。在全黑暗條件下，壞死斑直徑最大，分別達2.8mm和3.4mm。與晝夜交替條件下的產(chǎn)毒含量差異不顯著。在全光照條件下，壞死斑直徑最小，分別為2.0mm和2.3mm，且差異顯著。菌株xl-2，在全黑暗條件下，壞死斑直徑最大，達3.1mm，且差異顯著。在全光照條件下，壞死斑直徑最小，為1.9mm。說明黑暗條件有利于庫爾勒香梨腐爛病菌產(chǎn)毒。光照條件不適合庫爾勒香梨腐爛病菌產(chǎn)毒。

表7不同光照條件對庫爾勒香梨腐爛病菌產(chǎn)毒的影響

注：圖中數(shù)據(jù)為三次重復(fù)的平均值，小寫字母表示差異達0.05顯著水平

通過離體葉片針刺法能證明粗毒素對香梨葉片有毒害作用，離體葉片針刺法更加精確，本試驗數(shù)據(jù)均采用離體葉片法測定的壞死斑直徑。pd培養(yǎng)液、ps培養(yǎng)液、czapek培養(yǎng)液和葉片煎汁蔗糖培養(yǎng)液均能作為庫爾勒香梨腐爛病菌最優(yōu)產(chǎn)毒培養(yǎng)液。1天的處理條件不利于香梨腐爛病菌產(chǎn)毒；1天到3天之間，產(chǎn)毒量增加迅速；3天后，病菌產(chǎn)毒含量基本保持在一個水平。所得最適合產(chǎn)毒的培養(yǎng)基溫度為20-30℃，其中25℃是最佳庫爾勒香梨腐爛病菌產(chǎn)毒的條件；溫度過高或過低都不利于病菌產(chǎn)毒。所得最適合產(chǎn)毒的培養(yǎng)基ph值為6-8,最佳產(chǎn)毒ph為7。黑暗較光照有利于產(chǎn)毒。振蕩條件比靜置培養(yǎng)有利于有利于庫爾勒香梨腐爛病菌產(chǎn)毒。綜上可知：最有利于庫爾勒香梨腐爛病菌產(chǎn)毒的培養(yǎng)方式是：ph值為7的培養(yǎng)液在25℃黑暗條件下振蕩培養(yǎng)3天以上。

以上所述，僅是本發(fā)明實施例的較佳實施例，并非對本發(fā)明實施例作任何形式上的限制，依據(jù)本發(fā)明實施例的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明實施例技術(shù)方案的范圍內(nèi)。