本發(fā)明涉及銀杏葉中黃酮類成分含量的測定方法,具體涉及一種多指標(biāo)成分定量測定銀杏葉中黃酮類成分含量的方法。
背景技術(shù)：
：銀杏又名公孫樹、白果樹等，其種子白果仁作為止咳平喘、縮小便、止帶濁的中藥在我國已有很久歷史。其葉子銀杏葉又稱白果葉，是銀杏科植物銀杏的干燥葉，味苦、甘澀、性平、小毒。銀杏葉藥用最早載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，早在宋朝我國民間就使用銀杏葉治療哮喘和支氣管炎。我國藥典中記載銀杏葉有潤肺、平喘、止痛之功效，用于肺虛咳嗽、冠心病心絞痛等。銀杏葉的化學(xué)成分很復(fù)雜，迄今已發(fā)現(xiàn)170多種化合物，主要為黃酮類、萜類、醇類、生物堿類、聚異戊二烯類、多糖等具有藥理作用的活性成分，有毒成分為銀杏酸。隨著銀杏葉生物活性成分藥理與毒理研究的深入，其藥用功能逐步探明。銀杏葉提取物是經(jīng)現(xiàn)代提取工藝從銀杏葉中提取的活性物質(zhì)的富集產(chǎn)品，其主要活性成分為黃酮類和萜類。可用于療肺虛咳喘、冠心病、高血脂、抑郁癥、糖尿病、神經(jīng)疾病、記憶障礙、外周血管疾病、間歇性跛行、腦轉(zhuǎn)耳鳴等疾病的治療。黃酮類成分包括單黃酮、黃酮醇苷、乙?；S酮醇苷、雙黃酮、黃烷-3-醇類以及原花色素等。銀杏黃酮具有擴(kuò)張冠狀血管、解痙、清除體內(nèi)自由基等功能。中國專利申請201310372406.8公開了一種銀杏葉藥材實(shí)時放行檢測方法，(1)采集銀杏葉藥材：采集不同產(chǎn)地的銀杏葉藥材樣本，經(jīng)粉碎后，過80目篩，得到粒度較均勻的銀杏葉藥材粉末；(2)測定銀杏葉藥材質(zhì)控指標(biāo)：選取水分含量、浸出物含量、黃酮醇苷含量作為銀杏葉藥材的關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)；水分含量采用烘干稱重法測定，浸出物含量采用熱浸法測定，均參照2010版《中國藥典》中對銀杏葉的相關(guān)測定方法；黃酮醇苷含量采用高效液相色譜法測定，其中液相色譜條件：色譜柱：agilentsb-c18分析柱，4.6×250mm，5μm；流動相：甲醇-0.4％磷酸溶液50:50；檢測波長360nm，流速為1ml/min，進(jìn)樣量為10μl；(3)采集銀杏葉藥材近紅外光譜數(shù)據(jù)：稱取銀杏葉藥材粉末，置于稱量瓶中，保持粉末表面平整，采用漫反射法采集近紅外光譜，以空氣為參比，掃描次數(shù)為32，分辨率為8cm-1，掃描光譜范圍為4000-10000cm-1；(4)建立銀杏葉藥材各質(zhì)控指標(biāo)的近紅外定量模型和實(shí)時放行的定量標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)用化學(xué)計量學(xué)軟件將所得的近紅外光譜信息與參比方法所測得的標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行關(guān)聯(lián)，采用偏最小二乘法建立近紅外光譜與質(zhì)控指標(biāo)之間的定量校準(zhǔn)模型；(5)建立銀杏葉藥材質(zhì)量的近紅外定性模型和實(shí)時放行的定性標(biāo)準(zhǔn)。該方法可以在一定程度上保證銀杏葉制劑批次間的穩(wěn)定性和均一性。但該方法僅測試槲皮索、山柰素、異鼠李素3個含量,再折算成總黃酮醇苷的含量，對于黃酮醇苷類原型成分不能有效的控制其含量。目前對銀杏葉、銀杏葉提取物以及制劑中黃酮類化合物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究,僅停留在采用酸水解,測定槲皮索、山柰素、異鼠李素3個含量,折算成總黃酮醇苷的含量的方法上,對于黃酮醇苷類原型成分的控制為空白。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種多指標(biāo)成分定量測定銀杏葉中黃酮類成分含量的方法，彌補(bǔ)現(xiàn)有藥材質(zhì)量控制技術(shù)不夠完善和科學(xué)的不足，更好的控制銀杏葉提取物的質(zhì)量。本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種多指標(biāo)成分定量測定銀杏葉中黃酮類成分含量的方法；該方法使用的對照品包括：取蘆丁(rutin)、山柰酚-3-o-蕓香糖苷(kgr)、異鼠李素-3-o-蕓香糖苷(igr)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-ol-對羥基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(qrcg)和山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-對羥基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)。進(jìn)一步地，所述多指標(biāo)成分定量測定銀杏葉中黃酮類成分含量的方法，包括以下步驟：(1)供試品溶液的制備稱取銀杏葉提取物加甲醇稀釋；(2)對照品溶液的制備稱取蘆丁(rutin)、山柰酚-3-o-蕓香糖苷(kgr)、異鼠李素-3-o-蕓香糖苷(igr)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-對羥基反式桂皮酰)葡萄糖苷(qrcg)和山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-對羥基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)對照品適量，加甲醇制成每1ml分別含75μg、70μg、60μg、35μg、75μg、75μg的溶液，即得；(3)測定方法分別吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測定，分別計算蘆丁(rutin)、山柰酚-3-o-蕓香糖苷(kgr)、異鼠李素-3-o-蕓香糖苷(igr)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-對羥基反式桂皮酰)葡萄糖苷(qrcg)和山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-對羥基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)的總量，計算6個黃酮醇苷的總量；其中，所述的液相色譜檢測的條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以流動相a：乙腈、流動相b：0.4％磷酸,按下表進(jìn)行梯度洗脫；平衡時間10分鐘；流速每分鐘為0.8-1.2m1；檢測波長為355-365nm；柱溫45-48℃；理論板數(shù)按蘆丁峰計算大于等于10oo0。進(jìn)一步地，所述流速每分鐘為0.8-1.2m1。進(jìn)一步地，所述檢測波長為355-365nm進(jìn)一步地，所述柱溫為48℃。進(jìn)一步地，所述供試品溶液的制備：精確稱取銀杏葉提取物約50mg,至25ml容量瓶中，加入甲醇定容至25ml，經(jīng)0.22μm濾膜過濾即得。色譜柱的選擇本發(fā)明通過大量的實(shí)驗(yàn)篩選了不同的色譜柱，采用以下型號的色譜柱進(jìn)行測定：①inertsilrods-3c18250mm×4.6mm5μm②ymc-packods-aq4.6×250mms-5μmno.0425059787③phenomenexgemini5μm110ac184.6×250mms/no.648173-11④inertsilods-3c18250mm×4.6mms-5μms/n1a7130799⑤thermosyncronisc18250×4.6mm5μm篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，選用inertsilrods-3c18250mm×4.6mm5μm色譜峰分離良好，重現(xiàn)性最好。柱溫的選擇本發(fā)明分別在43℃、45℃和48℃柱溫下進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表時，在48℃柱溫條件下，色譜峰分離情況最好，因此，將48℃作為最佳的柱溫條件。本發(fā)明的方法穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好，色譜條件容易實(shí)現(xiàn)；通過對黃酮醇苷類原型成分的測定，能準(zhǔn)確、全面地控制銀杏葉總黃酮的質(zhì)量。為銀杏葉提取物及其制劑的質(zhì)量控制了新的分析方法并提供依據(jù)。附圖說明圖1混合對照品液相色譜圖圖2樣品液相色譜圖具體實(shí)施方式實(shí)施例1多指標(biāo)成分定量測定銀杏葉中黃酮類成分含量的方法1、儀器與藥品1.1waters2689高效液相色譜儀1.2試劑與藥品乙腈為色譜純；磷酸為優(yōu)級純；共它試劑均為分析純；水為超純水。2、實(shí)驗(yàn)與結(jié)果2.1色譜條件為：色譜柱為：inertsilrods-3c18250mm×4.6mm5μm；以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以流動相a：乙腈、流動相b：0.4％磷酸,按下表進(jìn)行梯度洗脫；平衡時間10分鐘；流速每分鐘為1.0m1；檢測波長為36onm；柱溫48℃；理論板數(shù)按蘆丁峰計算大于等于10oo0。2.2多指標(biāo)成分定量測定銀杏葉中黃酮類成分含量的方法，包括以下步驟：(1)供試品溶液的制備精確稱取銀杏葉提取物約50mg,至25ml容量瓶中，加入甲醇定容至25ml，經(jīng)0.22μm濾膜過濾即得。(2)對照品溶液的制備稱取蘆丁(rutin)、山柰酚-3-o-蕓香糖苷(kgr)、異鼠李素-3-o-蕓香糖苷(igr)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-對羥基反式桂皮酰)葡萄糖苷(qrcg)和山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-對羥基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)對照品適量，加甲醇制成每1ml分別含75μg、70μg、60μg、35μg、75μg、75μg的溶液，即得；色譜圖見圖1。(3)測定方法分別吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測定，分別計算蘆丁(rutin)、山柰酚-3-o-蕓香糖苷(kgr)、異鼠李素-3-o-蕓香糖苷(igr)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-對羥基反式桂皮酰)葡萄糖苷(qrcg)和山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-對羥基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)的總量，計算6個黃酮醇苷的總量。2.3線性關(guān)系考察精密吸取對照品溶液(含rutin0.1996mg/ml，kgr0.2184mg/ml，igr0.1757mg/ml，krg0.1085mg/ml，qrcg0.2258mg/ml，krcg0.2181mg/ml)2μl、4μl、6μl、8μl、10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，計算回歸方程。結(jié)果見表1。表1成分回歸方程線性范圍(μg)相關(guān)系數(shù)(r)rutiny＝1809156x+70130.3933～1.99950.9999kgry＝1368942x-11070.4298～1.99160.9999igry＝1686403x-13100.3502～1.75490.9999krgy＝990565x-19350.2131～1.08620.9999qrcgy＝965477x-45310.4506～2.25910.9999krcgy＝891906x+9480.4337～2.18430.99992.4精密度試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，rutin、kgr、igr、krg、qrcg和krcg的峰面積的rsd在0.58％-0.95％之間，均小于2％。結(jié)果表明：所建立的方法精密度良好。2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液，分別于配制后0、2、4、8、16、24小時，依法測定，結(jié)果表明，供試品溶液在24小時內(nèi)基本穩(wěn)定，峰面積的rsd在0.33％-0.73％之間，均小于2％，可見樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.6重復(fù)性試驗(yàn)精密取6份供試品溶液，進(jìn)行測定，各峰面積的rsd在0.54％-0.81％之間，均小于2％。結(jié)果表明，測定方法重現(xiàn)性良好。2.7準(zhǔn)確度及范圍試驗(yàn)采用加樣回收法，1)精密稱取0.5ml混合對照品溶液(含rutin0.07760mg/ml，kgr0.07153mg/ml，igr0.05992mg/ml，krg0.03547mg/ml，qrcg0.07824mg/ml，krcg0.07871mg/ml)，及同一已知含量的供試品溶液0.5ml，置于2ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；2)精密稱取已知含量的同一供試品溶液1.0ml及上述混合對照品1.0ml，混勻；3)精密稱取上述混合對照品2.0ml，蒸干，精密加入已知含量的同一供試品溶液2.0ml，使溶解，平行制備3份，進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，回收率rsd在0.36％-2.23％范圍內(nèi)，均小于3％；表明本方法具有很好的準(zhǔn)確度。2.8銀杏葉提取物含量檢測按照2.2(1)對銀杏葉提取物進(jìn)行處理，進(jìn)樣測試。含量測定結(jié)果見表2。表2銀杏葉提取物含量測定結(jié)果mg/ml樣品rutinkgricrkrgqrcgkrcg6者之和10.08850.0910.08340.060.08310.05620.46220.08560.08870.08180.05940.0830.0570.45630.08950.09170.08350.06030.0820.05560.46340.06420.07480.08270.06620.10050.06690.45550.07980.06860.06920.05790.08920.05630.42160.6170.06210.06530.06930.10580.07160.436上述詳細(xì)說明是針對本發(fā)明其中之一可行實(shí)施例的具體說明，該實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明所為的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁12