本發(fā)明涉及食品檢驗檢疫領(lǐng)域，更特別地，涉及一種測定生鮮乳樣品中的多種霉菌毒素含量的方法。

背景技術(shù)：

牛奶已成為人們生活的必需品，尤其嬰幼兒牛奶是母乳的最佳替代品，但霉菌毒素已成為牛奶的主要質(zhì)量安全風(fēng)險因子之一，嚴(yán)重威脅人類健康。霉菌毒素在牛奶加工過程中，無論是巴氏殺菌還是高溫殺菌均無法降解霉菌毒素，霉菌毒素可以完整殘留至奶產(chǎn)品中，因此，牛奶中霉菌毒素越來越受到人們的廣泛關(guān)注。

目前，監(jiān)測牛奶中霉菌毒素污染狀況的方法主要為酶聯(lián)免疫吸附法，該方法廣泛應(yīng)用于霉菌毒素分析檢測，但由于假陽性和不能精確定量等缺點限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。因此，基于薄層色譜法、氣相色譜、高壓液相色譜等技術(shù)的定量檢測方法已經(jīng)建立，但這些方法只能檢測一種或一類霉菌毒素，已不能滿足現(xiàn)代奶業(yè)中霉菌毒素的監(jiān)測和科研需求。

因此，需要一種新的測定生鮮乳中的多種霉菌毒素的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決以上問題，本發(fā)明提供了一種測定生鮮乳樣品中的多種霉菌毒素含量的方法，其包括以下步驟：

s1：從所述生鮮乳樣品中提取霉菌毒素提取物；

s2：對所述霉菌毒素提取物進(jìn)行液相色譜分離，得到洗脫級分；

s3：使用四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀對所述洗脫級分進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，確定霉菌毒素的種類和含量。

本發(fā)明采用具有高分辨率、高質(zhì)量精度的四極桿-靜電場軌道阱高分辨率質(zhì)譜儀，可更好地分離目標(biāo)化合物和干擾雜質(zhì)；可提供可靠、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。本方法通過四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜的選擇離子掃描提取各霉菌毒素的一級質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行定性和定量，同時自動觸發(fā)二級質(zhì)譜采集到每個霉菌毒素的二級質(zhì)譜圖，與標(biāo)準(zhǔn)品的二級質(zhì)譜圖對照，進(jìn)一步對化合物進(jìn)行確認(rèn)。

優(yōu)選地，所述多種霉菌毒素為以下霉菌毒素中的多種：黃曲霉毒素m2、黃曲霉毒素m1、黃曲霉毒素g2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素b1、β-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素b和赭曲霉毒素a。

優(yōu)選地，s1中使用體積分?jǐn)?shù)為5-10％的乙腈水溶液從所述生鮮乳樣品中提取所述霉菌毒素提取物。體積分?jǐn)?shù)為5-10％的乙腈水溶液可有效提取所有14種霉菌毒素，提取率超過純水和體積分?jǐn)?shù)20％的乙腈水溶液。

進(jìn)一步地，s1包括以下步驟：

s11：取生鮮乳樣品，4500rpm離心后進(jìn)行中速濾紙過濾；

s12：將s11中過濾得到的濾液與所述乙腈水溶液混勻；

s13：使s13得到的混合溶液通過三合一多毒素抗體親和柱，并用甲醇洗脫，吹干，得到霉菌毒素殘渣，所述三合一多毒素抗體親和柱上固定有抗黃曲霉毒素抗體、抗赭曲霉毒素抗體和抗玉米赤酶烯酮毒素抗體；

s14：用體積分?jǐn)?shù)10％的甲醇水溶液溶解所述霉菌毒素殘渣，用0.22μm的濾膜過濾，得到所述霉菌毒素提取物。

優(yōu)選地，s2中液相色譜使用kinetexc18色譜柱。

優(yōu)選地，所述四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀采取sim模式定量。

優(yōu)選地，還設(shè)置有不含霉菌毒素的生鮮乳作為陰性對照。

附圖說明

圖1為使用不同的提取溶劑提取霉菌毒素得到的14種霉菌毒素的回收率統(tǒng)計圖；

圖2為14種霉菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)統(tǒng)計圖。

具體實施方式

以下結(jié)合實例對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

1.生鮮乳中霉菌毒素的提取

取100g添加有14種霉菌毒素的生鮮乳，4500rpm離心10min后，中速濾紙過濾。稱取20.0g濾液，加入20ml10％乙腈水溶液(體積比)，搖勻后通過3合一多毒素免疫親和柱。完成后，用20ml超純水約清洗親和柱。擠干親和柱中水分后，使用3ml甲醇洗脫，40℃用氮?dú)獯蹈上疵撘骸Ｊ褂?.0ml10％甲醇水溶液(體積比)溶解殘渣，過0.22μmptfe濾膜，待液相色譜測試。所述14中霉菌毒素分別為黃曲霉毒素m2、黃曲霉毒素m1、黃曲霉毒素g2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素b1、β-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素b和赭曲霉毒素a。

以不含不含霉菌毒素的生鮮乳為對照。

2.液相色譜

將上述處理得到的樣品進(jìn)行液相色譜，條件如下：

1)色譜柱：kinetexc18,100*2.1mm(i.d.),1.7μm，或相當(dāng)者；

2)流動相：流動相a：水溶液(含0.01％甲酸/體積比、0.1mm甲酸銨)；流動相b：甲醇。梯度洗脫程序見表1；

流速：300μl/min(洗脫程序1)；

柱溫：45℃；

進(jìn)樣量：5μl。

表1液相色譜的梯度洗脫程序

3.質(zhì)譜

使用四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，質(zhì)譜條件和參數(shù)如下：

離子化模式：電噴霧電離正負(fù)離子模式(esi±)

電壓：4.0kv；

質(zhì)譜掃描方式：sim/dd-ms2模式；

分辨率：m/z為200處70000；

毛細(xì)管溫度：250℃；

鞘氣：45a.u.；

輔助氣：10a.u；

s-lenslevel：50.0；

自動增益控制：1.0e6；

最大注入時間：250ms；

歸一化碰撞能量：40；

表214種霉菌毒素的uhplc/esiq-orbitrap參數(shù)

4.測定

根據(jù)樣液中被測化合物的含量情況，選定濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行分析。按濃度由小到大的順序依次分析混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，得到混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度與峰面積的工作曲線?；旌匣|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液中待測化合物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器的檢測線性范圍內(nèi)。對混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液等體積進(jìn)樣測定。

5.結(jié)果計算與表述

采用外標(biāo)法定量，按以下公式計算殘留量。計算結(jié)果需扣除空白值。

式中：

x—試樣中被測組分殘留量，單位為微克每千克(μg/kg)；

c—從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的被測組分溶液濃度，單位為納克每毫升(ng/ml)；

v—樣品溶液最終定容體積，單位為毫升(ml)；

m—最終樣品溶液所代表的試樣質(zhì)量，單位為克(g)。

6.測定低限

生鮮乳中黃曲霉毒素m2，黃曲霉毒素m1，赭曲霉毒素b，赭曲霉毒素a，測定低限為0.0003μg/kg；黃曲霉毒素g2，黃曲霉毒素g1，黃曲霉毒素b2，黃曲霉毒素b1測定低限為0.001μg/kg；玉米赤霉酮，α-玉米赤霉烯醇，β-玉米赤霉烯醇測定低限為0.003μg/kg；玉米赤霉烯酮，α-玉米赤霉醇，β-玉米赤霉醇測定低限為0.008μg/kg。

7.回收率

回收率可指示方法的提取效率。14種霉菌毒素在生鮮乳中的添加濃度及回收率如表3所示，從表中可知，本發(fā)明的方法能夠檢測到這14種霉菌毒素，并進(jìn)行定量。

表314種霉菌毒素在生鮮乳中的添加濃度及回收率

8.不同提取溶劑對回收率的影響

對生鮮乳分別使用以下溶劑提取霉菌毒素：不提取、純水、體積分?jǐn)?shù)5％的乙腈水溶液、10％乙腈水溶液和20％乙腈水溶液。得到的提取物進(jìn)行液相色譜和質(zhì)譜進(jìn)行檢測，得到的回收率如圖1所示，從圖中可知，使用5％和10％的乙腈水溶液對這14種霉菌毒素的提取效率都比較高。

9.基質(zhì)效應(yīng)

用試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液對基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量，以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的回收率反映基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)測定結(jié)果如圖2所示，各項待測霉菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)均在5％以內(nèi)，說明三合一多毒素抗體親和柱選擇性很高，對樣品的凈化效果很好，基本上去除了基質(zhì)效應(yīng)，可以使用純?nèi)軇?biāo)樣進(jìn)行校正。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。