本發(fā)明屬于藥物分析領(lǐng)域，具體涉及一種艾氟康唑光學(xué)異構(gòu)體的液相分析方法。

背景技術(shù)：

艾氟康唑，化學(xué)名為(2r,3r)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(4-亞甲基哌啶-1-基)-1-(1h-1,2,4-三唑-1-基)-2-丁醇，是首個外用三唑類抗真菌藥物，由加拿大valeant制藥公司研發(fā)，2014年6月6日獲fda批準(zhǔn)上市，商品名jublia。該藥為10％的溶液，局部涂用，主要用于治療由紅色毛癬菌、石膏樣毛癬菌引起的手、足癬，其作用機(jī)制是抑制真菌14-去甲基化酶，從而干擾麥角甾醇的合成。艾氟康唑結(jié)構(gòu)中存在2個手性中心，共有4種光學(xué)異構(gòu)體，除具有藥理活性的2r/3r構(gòu)型(1)外，還有2s/3s構(gòu)型(2)、2r/3s構(gòu)型(3)和2s/3r構(gòu)型(4)。

四種不同構(gòu)型的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下所示：

按照研發(fā)立體異構(gòu)體新藥的相關(guān)技術(shù)要求，有必要建立一套完善的分析方法對艾氟康唑的光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制和產(chǎn)品質(zhì)量評價。李佩杰提供了一種艾氟康唑中4種光學(xué)異構(gòu)體的hplc測定方法(中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2016,47)，但是該方法采用的是手性色譜柱(daicelchiralpakic手性柱)。眾所周知，手性色譜柱較為昂貴，且使用壽命短，使用手性色譜柱開發(fā)的液相分析方法具有較高的應(yīng)用成本。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種更為經(jīng)濟(jì)的分離分析艾氟康唑及其異構(gòu)體的液相分析方法。

本發(fā)明通過下面的技術(shù)方案得以實現(xiàn)：

一種艾氟康唑光學(xué)異構(gòu)體的液相分析方法，液相色譜法的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動相為乙腈水溶液，乙腈體積百分濃度為25-45％，該乙腈水溶液中含有有效濃度的l-蘇氨酸和d-蘇氨酸，l-蘇氨酸和d-蘇氨酸的摩爾比為2-4:1。

優(yōu)選地，l-蘇氨酸、d-蘇氨酸摩爾比為3:1。

優(yōu)選地，所述l-蘇氨酸、d-蘇氨酸的摩爾濃度之和為0.3-0.5μmol/l。

優(yōu)選地，所述的液相分析方法包括如下色譜參數(shù)：

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠(c18)色譜柱；

流動相a相：25％乙腈水溶液，l-蘇氨酸、d-蘇氨酸分別為0.3μmol/l、0.1μmol/l；

流動相b相：45％乙腈水溶液，l-蘇氨酸、d-蘇氨酸分別為0.3μmol/l、0.1μmol/l；

洗脫程序：0-5min，0％b相；5-8min，0％→50％b相；8-10min，50％→100％b相；10-25min，100％b相；流速：0.7-0.9ml/min；

柱溫：33-37℃；

檢測波長：208-212nm。

優(yōu)選地，流速為0.8ml/min。

優(yōu)選地，柱溫為35℃。

優(yōu)選地，檢測波長為210nm。

優(yōu)選地，十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱的規(guī)格為長250mm、內(nèi)徑4.6mm、填料粒徑5μm。

優(yōu)選地，所述十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱優(yōu)選thermoscientific^tmacclaim^tm120c18。

本發(fā)明的優(yōu)點：

本發(fā)明提供的液相分析方法無需借助手性色譜柱，應(yīng)用成本低，易于推廣。

附圖說明

圖1為艾氟康唑及其異構(gòu)體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式；

圖2為混合對照品溶液使用實施例1液相分析方法的分離效果圖；

圖3為供試品溶液使用實施例1液相分析方法的分離效果圖；

圖4為混合對照品溶液使用實施例2液相分析方法的分離效果圖；

圖5為混合對照品溶液使用實施例3液相分析方法的分離效果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步介紹本發(fā)明的技術(shù)方案。

實施例1艾氟康唑光學(xué)異構(gòu)體的液相分析方法

一、實驗材料

島津lc-20a高效液相色譜儀；

cpa225d電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；

色譜柱：thermoscientific^tmacclaim^tm120c18；

艾氟康唑原料藥自制，艾氟康唑(1)及其2s/3s(2)、2r/3s(3)、2s/3r(4)異構(gòu)體的對照品自制(純度大于98％)，艾氟康唑及其異構(gòu)體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示；

d-蘇氨酸(cas號632-20-2，百靈威科技有限公司，純度98％)；

l-蘇氨酸(cas號6028-28-0，成都貝斯特試劑有限公司，純度99％)；

乙腈為色譜純，水為去離子水，其余試劑均為分析純。

二、實驗方法和結(jié)果

1、溶液配制

樣品稀釋劑：25％乙腈水溶液，含0.3μmol/l的l-蘇氨酸、0.1μmol/l的d-蘇氨酸。

對照品溶液：分別精密稱取1-4對照品10mg，各置100ml量瓶中，用樣品稀釋劑溶解并定容，搖勻，即得濃度為100μg/ml的1-4對照品溶液。

混合對照品溶液：將1-4對照品溶液等體積混合，得濃度各25μg/ml的混合對照品溶液。

供試品溶液：精密稱取艾氟康唑原料藥100mg，置100ml量瓶中，用樣品稀釋劑溶解并定容，搖勻，即得濃度為1mg/ml的供試品溶液。

2、色譜條件

色譜柱：thermoscientific^tmacclaim^tm120c18；

流動相a相：25％乙腈水溶液，l-蘇氨酸、d-蘇氨酸分別為0.3μmol/l、0.1μmol/l；

流動相b相：45％乙腈水溶液，l-蘇氨酸、d-蘇氨酸分別為0.3μmol/l、0.1μmol/l；

洗脫程序：0-5min，0％b相；5-8min，0％→50％b相；8-10min，50％→100％b相；10-25min，100％b相；流速：0.8ml/min；

柱溫：35℃；

檢測波長：210nm；

進(jìn)樣量：20μl。

3、系統(tǒng)適用性試驗

分別精密量取1-4對照品溶液和混合對照品溶液，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，出峰順序依次為1、2、3、4，理論板數(shù)均大于10000，分離度均大于1.5，拖尾因子均小于1.15，空白溶劑不干擾測定，混合對照品溶液色譜圖見圖2。

4、線性關(guān)系考察

分別精密稱取1-4對照品適量，用流動相分別溶解并稀釋，制成0.5、5、10、20、50、80、100和120μg/ml的系列濃度溶液，進(jìn)樣測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。異構(gòu)體1-4在上述濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r²＞0.9999。

5、靈敏度考察

精密稱取1-4異構(gòu)體對照品各適量，加稀釋液溶解并稀釋至4種異構(gòu)體峰高約為基線噪音的3倍。結(jié)果各異構(gòu)體的最低檢出限均約為1.1×10^-3μg，靈敏度高。

6、加樣回收率試驗

按常規(guī)方法配制回收率測定溶液，計算各異構(gòu)體的回收率，結(jié)果證明艾氟康唑4種異構(gòu)體的回收率均在98-102％之間(rsd＜1.5％，n＝3)，符合要求。

7、精密度和穩(wěn)定性試驗

取上述混合對照品溶液和供試品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果rsd均小于2.0％(n＝6)，表明本方法精密度良好。

分別取上述混合對照品溶液和供試品溶液，于室溫放置，分別于0、4、8、12、24h進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果艾氟康唑4種異構(gòu)體的峰面積在24h內(nèi)的rsd均小于2.0％(n＝5)，表明混合對照品溶液室溫放置24h穩(wěn)定。

8、原料藥測定

取樣品適量，按上述方法制備混合對照品溶液和供試品溶液，分別進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中如有與混合對照品溶液色譜圖中各異構(gòu)體保留時間相同的雜質(zhì)峰，按外標(biāo)法以峰面積計算各異構(gòu)體的含量。供試品溶液色譜圖如圖3所示。原料藥中僅僅檢出2s/3r(4)異構(gòu)體，其在三批樣品中的含量分別為0.04％、0.05％、0.04％。

實施例2對比實施例，流動相僅添加l-蘇氨酸

一、實驗材料

島津lc-20a高效液相色譜儀；

cpa225d電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；

色譜柱：thermoscientific^tmacclaim^tm120c18；

艾氟康唑原料藥自制，艾氟康唑(1)及其2s/3s(2)、2r/3s(3)、2s/3r(4)異構(gòu)體的對照品自制(純度大于98％)，艾氟康唑及其異構(gòu)體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示；

l-蘇氨酸(cas號6028-28-0，成都貝斯特試劑有限公司，純度99％)

乙腈為色譜純，水為去離子水，其余試劑均為分析純。

二、實驗方法和結(jié)果

1、溶液配制

樣品稀釋劑：25％乙腈水溶液，含0.3μmol/l的l-蘇氨酸。

對照品溶液：分別精密稱取1-4對照品10mg，各置100ml量瓶中，用樣品稀釋劑溶解并定容，搖勻，即得濃度為100μg/ml的1-4對照品溶液。

混合對照品溶液：將1-4對照品溶液等體積混合，得濃度各25μg/ml的混合對照品溶液。

2、色譜條件

色譜柱：thermoscientific^tmacclaim^tm120c18；

流動相a相：25％乙腈水溶液，l-蘇氨酸為0.3μmol/l；

流動相b相：45％乙腈水溶液，l-蘇氨酸為0.3μmol/l；

洗脫程序：0-5min，0％b相；5-8min，0％→50％b相；8-10min，50％→100％b相；10-25min，100％b相；流速：0.8ml/min；

柱溫：35℃；

檢測波長：210nm；

進(jìn)樣量：20μl。

3、系統(tǒng)適用性試驗

精密量取混合對照品溶液，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果艾氟康唑(1)、2s/3s(2)、2r/3s(3)、2s/3r(4)異構(gòu)體不能實現(xiàn)兩兩分離，混合對照品溶液色譜圖見圖4。

實施例3對比實施例，流動相僅添加d-蘇氨酸

一、實驗材料

島津lc-20a高效液相色譜儀；

cpa225d電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；

色譜柱：thermoscientific^tmacclaim^tm120c18；

艾氟康唑原料藥自制，艾氟康唑(1)及其2s/3s(2)、2r/3s(3)、2s/3r(4)異構(gòu)體的對照品自制(純度大于98％)，艾氟康唑及其異構(gòu)體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示；

d-蘇氨酸(cas號632-20-2，百靈威科技有限公司，純度98％)；

乙腈為色譜純，水為去離子水，其余試劑均為分析純。

二、實驗方法和結(jié)果

1、溶液配制

樣品稀釋劑：25％乙腈水溶液，含0.1μmol/l的d-蘇氨酸。

對照品溶液：分別精密稱取1-4對照品10mg，各置100ml量瓶中，用樣品稀釋劑溶解并定容，搖勻，即得濃度為100μg/ml的1-4對照品溶液。

混合對照品溶液：將1-4對照品溶液等體積混合，得濃度各25μg/ml的混合對照品溶液。

2、色譜條件

色譜柱：thermoscientific^tmacclaim^tm120c18；

流動相a相：25％乙腈水溶液，d-蘇氨酸為0.1μmol/l；

流動相b相：45％乙腈水溶液，d-蘇氨酸為0.1μmol/l；

洗脫程序：0-5min，0％b相；5-8min，0％→50％b相；8-10min，50％→100％b相；10-25min，100％b相；流速：0.8ml/min；

柱溫：35℃；

檢測波長：210nm；

進(jìn)樣量：20μl。

3、系統(tǒng)適用性試驗

精密量取混合對照品溶液，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果艾氟康唑(1)、2s/3s(2)、2r/3s(3)、2s/3r(4)異構(gòu)體不能實現(xiàn)兩兩分離，混合對照品溶液色譜圖見圖5。

本發(fā)明提供的液相分析方法無需借助手性色譜柱，應(yīng)用成本低，易于推廣。