本發(fā)明屬于基因檢測光學(xué)成像技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種基因分子熒光非直觀顯微成像裝置及方法。
背景介紹
基因測組作為目前生物學(xué)領(lǐng)域最炙手可熱的專業(yè)門類之一，近幾年在國內(nèi)外均得到了快速的發(fā)展，它不僅能夠追蹤傳染病途徑，還能預(yù)測個(gè)體化疾病風(fēng)險(xiǎn)，有效預(yù)測癌癥、糖尿病、唐氏綜合征等多種疾病，從而為后期的防御和治療提供有效的幫助。
在當(dāng)前所有的測序技術(shù)中，第三代測序技術(shù)處于領(lǐng)先地位，其中技術(shù)較為完善的是采用熒光成像光學(xué)檢測方法的測序方法。然而由于紅光的衍射極限，基因測序芯片上dna納米球間距只能控制在600納米，而進(jìn)一步提高這個(gè)方法的測量效率受到分辨力和測量速度的限制。因此基因測序需要采用能夠突破衍射極限的光學(xué)超顯微成像技術(shù)來進(jìn)一步提高測量效率。在現(xiàn)有顯微成像領(lǐng)域，傳統(tǒng)光學(xué)顯微受衍射極限影響，分辨率被限制在100nm左右。分辨率最高的是以電子和離子等非光學(xué)信息為載體的顯微技術(shù)，如掃描電子顯微鏡(sem)與原子力顯微鏡(afm)等，能實(shí)現(xiàn)0.1nm級分辨，而掃描隧道顯微鏡(stm)則能實(shí)現(xiàn)0.01nm級分辨。但是，這些高分辨顯微技術(shù)都有測量效率低、環(huán)境適應(yīng)性差、易對試樣造成損傷、制造和使用價(jià)格高等問題，滿足不了基因測序的實(shí)際工程需要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種成本低、效率高、分辨率高的基因分子熒光非直觀顯微成像裝置及方法。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)解決方案為：一種基因分子熒光非直觀顯微成像裝置，包括計(jì)算機(jī)、電機(jī)驅(qū)動器、熒光顯微鏡模塊，其中熒光顯微鏡模塊包括黑白ccd相機(jī)、微型電機(jī)、1/4波片和檢偏器，其中1/4波片通過微型電機(jī)帶動進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，熒光顯微鏡的截止濾光片與黑白ccd相機(jī)之間設(shè)置微型電機(jī)，1/4波片置于微型電機(jī)中心處，1/4波片與黑白ccd相機(jī)之間設(shè)置檢偏器；計(jì)算機(jī)通過電機(jī)驅(qū)動器接入微型電機(jī)，黑白ccd相機(jī)與計(jì)算機(jī)連接。
將待測dna微陣列放置于熒光顯微鏡的載物臺，打開熒光顯微鏡的高壓汞燈對載物臺上的樣品進(jìn)行照明，同時(shí)由計(jì)算機(jī)驅(qū)動電機(jī)驅(qū)動器和黑白ccd相機(jī)，控制微型電機(jī)轉(zhuǎn)動和黑白ccd相機(jī)采圖，其中微型電機(jī)控制1/4波片進(jìn)行周期性的轉(zhuǎn)動，每轉(zhuǎn)動固定角度黑白ccd相機(jī)通過檢偏器和波片進(jìn)行一次采圖，多次采樣得到多幅帶有不同偏振信息的基因分子的熒光圖，ccd相機(jī)所采集的帶有不同偏振信息的基因分子的熒光圖輸入計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理，從而獲得待測dna微陣列芯片上的基因分子的熒光非直觀圖像。
優(yōu)選地，所述微型電機(jī)(6)采用伺服電機(jī)，伺服電機(jī)控制速度可在0-20°/s范圍內(nèi)變動，位置精度可達(dá)到0.02°。
優(yōu)選地，所述檢偏器(4)可透過可見光波段的光。
優(yōu)選地，所述1/4波片(5)可對可見光波段的光進(jìn)行相位延遲。
一種基于所述基因分子熒光非直觀顯微成像裝置的基因分子熒光非直觀顯微成像方法，步驟如下：
步驟1，將經(jīng)染色處理的dna微陣列作為試樣(10)置于熒光顯微鏡的載物臺上；
步驟2，打開熒光顯微鏡的高壓汞燈(12)對載物臺上的dna微陣列芯片(10)進(jìn)行照明，利用熒光顯微鏡和黑白ccd相機(jī)(3)獲得一幅基因分子的熒光光強(qiáng)圖片，作為未被處理的原始圖像并輸入計(jì)算機(jī)(1)；
步驟3，通過電機(jī)驅(qū)動器(2)驅(qū)動微型電機(jī)(6)控制1/4波片(5)進(jìn)行周期性的轉(zhuǎn)動，并且通過黑白ccd相機(jī)(3)采集圖像，獲得多幅基因分子的熒光光強(qiáng)圖并輸入計(jì)算機(jī)(1)；
步驟4，計(jì)算機(jī)(1)根據(jù)步驟3輸入的基因分子的熒光光強(qiáng)圖以及1/4波片(5)的旋轉(zhuǎn)角度計(jì)算得到基因分子的熒光光強(qiáng)圖的相位差和方位角；
步驟5，通過軟件將步驟4所得到的相位差、方位角值轉(zhuǎn)化形成灰度圖像，其中所成灰度圖像的每一個(gè)像素點(diǎn)的值代表相位差或方位角的大?。蝗缓蟾鶕?jù)灰度圖像中像素值的大小賦予圖像不同色彩，像素值相同的區(qū)域賦予相同的顏色，像素值不同則顏色不同，從而形成擁有更高對比度的假彩圖像；
步驟6，根據(jù)步驟3得到的基因分子的多幅熒光光強(qiáng)圖以及步驟4得到的相位差、方位角，由通過系統(tǒng)各個(gè)偏振元件的mueller矩陣確定的stokes矢量表達(dá)式計(jì)算出s0、s1、s2和s3四個(gè)stokes參量，并使用步驟5中灰度圖轉(zhuǎn)換成假彩圖像的方法得到stokes參量的假彩圖像。
進(jìn)一步地，步驟6所述根據(jù)相位差、方位角，通過mueller矩陣確定stokes參量并進(jìn)行stokes參數(shù)非直觀成像，所采用的公式為：
式中，idp是像素點(diǎn)所在每幅圖的平均光強(qiáng)信息，δ是相位差，
由上述6個(gè)步驟最終得到擁有更高辨識度的相位差、方位角、s0、s1、s2和s3等非直觀圖像。
本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比，主要顯著的有點(diǎn)有一下三個(gè)方面：(1)成本低：本發(fā)明的成本較低，主要是由光學(xué)元件構(gòu)成，一臺熒光顯微鏡，多個(gè)偏振器件，一臺計(jì)算機(jī)，一個(gè)電機(jī)組成，視場較大，不需要掃描等。(2)分辨率高：由于該方法采用了非直觀成像方法，利用偏振參數(shù)成像，通過計(jì)算多幅圖像，對點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)進(jìn)行瘦身，從而繞開了衍射極限，獲得高分辨率的假彩色圖像。(3)效率高：本發(fā)明采用的是光學(xué)成像方法，成像速度快，獲得各種偏振態(tài)下的圖像過程可控制在5分鐘以內(nèi)。
附圖說明
圖1是本發(fā)明基因分子熒光非直觀顯微成像裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
本發(fā)明利用熒光非直觀光波參數(shù)圖進(jìn)行基因分子形貌結(jié)構(gòu)分析，其中熒光非直觀光波參數(shù)圖是指利用成像光的相位差、位相角、stokes參數(shù)進(jìn)行成像?；蚍肿訜晒夥侵庇^顯微成像裝置的優(yōu)勢在于通過測量擬合來強(qiáng)化光學(xué)顯微系統(tǒng)的分辨。該裝置主要是依據(jù)一臺普通的熒光顯微鏡進(jìn)行改造，所以大大降低了裝置的設(shè)計(jì)難度。
包括計(jì)算機(jī)(1)、電機(jī)驅(qū)動器(2)和熒光顯微鏡模塊，其中熒光顯微鏡模塊包括黑白ccd相機(jī)(3)、檢偏器(4)、1/4波片(5)、微型電機(jī)(6)，其中1/4波片(5)通過微型電機(jī)(6)帶動進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，微型電機(jī)(6)在電機(jī)驅(qū)動器(2)的驅(qū)動下工作，所述電機(jī)驅(qū)動器(2)在計(jì)算機(jī)(1)的控制下工作，熒光顯微鏡的截止濾光片(7)與黑白ccd相機(jī)(3)之間設(shè)置微型電機(jī)(6)，1/4波片(5)在微型電機(jī)(6)的中心處，1/4波片(5)與黑白ccd相機(jī)(3)之間設(shè)置檢偏器(4)；計(jì)算機(jī)(1)通過電機(jī)驅(qū)動器(2)接入微型電機(jī)(6)，黑白ccd相機(jī)(3)與計(jì)算機(jī)(1)連接。
將待測dna微陣列(10)放置于熒光顯微鏡的載物臺，打開熒光顯微鏡的高壓汞燈(12)對載物臺上的樣品(10)進(jìn)行照明，同時(shí)由計(jì)算機(jī)驅(qū)動電機(jī)驅(qū)動器(2)和黑白ccd相機(jī)(3)，控制微型電機(jī)(6)轉(zhuǎn)動和黑白ccd相機(jī)(3)采圖，其中微型電機(jī)(6)控制1/4波片(5)進(jìn)行周期性的轉(zhuǎn)動，每轉(zhuǎn)動固定角度黑白ccd相機(jī)通過檢偏器(4)和1/4波片(5)進(jìn)行一次采圖，多次采樣得到多幅帶有不同偏振信息的基因分子的熒光圖，ccd相機(jī)(3)所采集的帶有不同偏振信息的基因分子的熒光圖輸入計(jì)算機(jī)(1)進(jìn)行處理，從而獲得待測dna微陣列芯片(10)上的基因分子的熒光非直觀圖像。
所述微型電機(jī)(6)采用伺服電機(jī)，伺服電機(jī)控制速度可在0-20°/s范圍內(nèi)變動，位置精度可達(dá)到0.02°。
所述起檢偏器(4)可透過可見光波段的光。
所述1/4波片(5)可對可見光波段的光進(jìn)行相位延遲。
非直觀算法的基本原理是：利用光的偏振信息進(jìn)行成像，對于各向異性的樣品進(jìn)行成像，通過利用線性雙折射的物理模型，獲得多幅不同偏振態(tài)下的光強(qiáng)信息，通過光強(qiáng)表達(dá)式，通過利用計(jì)算傅里葉級數(shù)系數(shù)的方法，獲得所需要的參數(shù)，從而獲得所需要的參數(shù)圖。
本發(fā)明基于權(quán)所述基因分子熒光非直觀顯微成像裝置的基因分子熒光非直觀顯微成像方法，步驟如下：
步驟1，將經(jīng)染色處理的dna微陣列作為試樣(10)置于熒光顯微鏡的載物臺上；
步驟2，打開熒光顯微鏡的高壓汞燈(12)對載物臺上的dna微陣列芯片(10)進(jìn)行照明，利用熒光顯微鏡和黑白ccd相機(jī)(3)獲得一幅基因分子的熒光光強(qiáng)圖片，作為未被處理的原始圖像并輸入計(jì)算機(jī)(1)；
步驟3，通過電機(jī)驅(qū)動器(2)驅(qū)動微型電機(jī)(6)控制1/4波片(5)進(jìn)行周期性的轉(zhuǎn)動，并且通過黑白ccd相機(jī)(3)采集圖像，獲得多幅基因分子的熒光光強(qiáng)圖并輸入計(jì)算機(jī)(1)；
所述的微型電機(jī)(6)控制1/4波片(5)進(jìn)行周期性旋轉(zhuǎn)，可以獲得不同相位延遲下的基因分子的熒光圖像，為非直觀光波參數(shù)成像提供足夠的光強(qiáng)信息。
步驟4，計(jì)算機(jī)1根據(jù)輸入的基因分子的熒光光強(qiáng)圖確定光強(qiáng)圖的相位差和方位角，具體如下：
根據(jù)jones矩陣得到光強(qiáng)函數(shù)i(ω)，
其中i0是扣除系統(tǒng)和樣品吸收后的光強(qiáng)，是系統(tǒng)透射率的最大值，通過多組光強(qiáng)函數(shù)的值擬合得到方位角
步驟5，通過軟件將步驟4所得到的相位差、方位角值轉(zhuǎn)化形成灰度圖像，其中所成灰度圖像的每一個(gè)像素點(diǎn)的值代表相位差或方位角的大??；然后根據(jù)灰度圖像中像素值的大小賦予圖像不同色彩，像素值相同的區(qū)域賦予相同的顏色，像素值不同則顏色不同，從而形成擁有更高對比度的假彩圖像；
步驟6，根據(jù)相位差、方位角，通過mueller矩陣確定stokes參量并進(jìn)行stokes參數(shù)非直觀成像，所采用的公式為：
式中，idp是像素點(diǎn)所在每幅圖的平均光強(qiáng)信息，δ是相位差，
本發(fā)明是利用偏振參數(shù)進(jìn)行基因分子熒光成像。先利用偏振調(diào)制，得到多幅單偏振狀態(tài)下的基因分子的熒光圖像，從中進(jìn)行參數(shù)提取，得到利用各參數(shù)值進(jìn)行成像的基因分子的熒光圖像。與直接利用遠(yuǎn)場的熒光光強(qiáng)進(jìn)行成像相比，偏振參數(shù)對于物體結(jié)構(gòu)各項(xiàng)異性的變化更加的靈敏，更為重要的是通過利用均方根擬合，篩選出擬合度高于95％的像素點(diǎn)，使得psf寬度變窄，這樣就可以突破光學(xué)成像的衍射極限，大大提高了成像的分辨率。因此，本發(fā)明提供了一種新的基因檢測光學(xué)顯微成像的方法，該方法基于非直觀參數(shù)成像技術(shù)，突破了衍射極限，獲得了高分辨率圖像。
綜合探測方法和所采用的微型電機(jī)，伺服電機(jī)能夠快速而精確的控制起偏器的旋轉(zhuǎn)與定位，從而實(shí)現(xiàn)不同偏振狀態(tài)的精確調(diào)制，且提高了成像的分辨率，該方法的優(yōu)勢是不需要進(jìn)行掃描，大大提高了成像效率并降低了成本。
綜上，本發(fā)明主要有三大優(yōu)勢：(1)成像速度快，(2)成本低，(3)成像的分辨率高。
實(shí)施例1
下面結(jié)合附圖詳細(xì)介紹該發(fā)明裝置進(jìn)行光波參數(shù)成像的步驟。
(1)結(jié)合附圖詳細(xì)介紹該發(fā)明裝置：
結(jié)合圖1，本發(fā)明利用熒光非直觀光波參數(shù)圖進(jìn)行基因分子結(jié)構(gòu)分析的裝置，包括計(jì)算機(jī)(1)、電機(jī)驅(qū)動器(2)和熒光顯微鏡模塊，其中熒光顯微鏡模塊包括黑白ccd相機(jī)(3)、檢偏器(4)、1/4波片(5)、微型電機(jī)(6)，其中1/4波片(5)通過微型電機(jī)(6)帶動進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，微型電機(jī)(6)在電機(jī)驅(qū)動器(2)的驅(qū)動下工作，所述電機(jī)驅(qū)動器(2)在計(jì)算機(jī)(1)的控制下工作，熒光顯微鏡的截止濾光片(7)與黑白ccd相機(jī)(3)之間設(shè)置微型電機(jī)(6)，1/4波片(5)在微型電機(jī)(6)的中心處，1/4波片(5)與黑白ccd相機(jī)(3)之間設(shè)置檢偏器(4)；計(jì)算機(jī)(1)通過電機(jī)驅(qū)動器(2)接入微型電機(jī)(6)，黑白ccd相機(jī)(3)與計(jì)算機(jī)(1)連接；
將待測dna微陣列(10)放置于熒光顯微鏡的載物臺，打開熒光顯微鏡的高壓汞燈(12)對載物臺上的樣品(10)進(jìn)行照明，同時(shí)由計(jì)算機(jī)驅(qū)動電機(jī)驅(qū)動器(2)和黑白ccd相機(jī)(3)，控制微型電機(jī)(6)轉(zhuǎn)動和黑白ccd相機(jī)(3)采圖，其中微型電機(jī)(6)控制1/4波片(5)進(jìn)行周期性的轉(zhuǎn)動，每轉(zhuǎn)動固定角度黑白ccd相機(jī)通過檢偏器(4)和1/4波片(5)進(jìn)行一次采圖，多次采樣得到多幅帶有不同偏振信息的基因分子的熒光圖，伺服電機(jī)控制速度可在0-20°/s范圍內(nèi)變動，位置精度可達(dá)到0.02°。檢偏器(4)可透過可見光波段的光。1/4波片(5)可對可見光波段的光進(jìn)行相位延遲。微型電機(jī)(6)控制1/4波片(5)進(jìn)行周期性旋轉(zhuǎn)，可以獲得不同偏振狀態(tài)下的基因分子的圖像，為非直觀光波參數(shù)成像提供足夠的熒光光強(qiáng)信息。計(jì)算機(jī)(1)中的算法集成軟件，可以將所獲得多幅光強(qiáng)圖進(jìn)行非直觀算法的計(jì)算，最終獲得各種參數(shù)圖像，也就是非直觀光波參數(shù)圖像。
(2)實(shí)現(xiàn)對該裝置的光波參數(shù)成像方法的具體步驟如下：
步驟1，將經(jīng)染色處理的dna微陣列作為試樣(10)置于熒光顯微鏡的載物臺上；
步驟2，打開熒光顯微鏡的高壓汞燈(12)對載物臺上的dna微陣列芯片(10)進(jìn)行照明，利用熒光顯微鏡和黑白ccd相機(jī)(3)獲得一幅基因分子的熒光光強(qiáng)圖片，作為未被處理的原始圖像并輸入計(jì)算機(jī)(1)；
步驟3，通過電機(jī)驅(qū)動器(2)驅(qū)動微型電機(jī)(6)控制1/4波片(5)進(jìn)行周期性的轉(zhuǎn)動，并且通過黑白ccd相機(jī)(3)采集圖像，獲得多幅基因分子的熒光光強(qiáng)圖并輸入計(jì)算機(jī)(1)；
步驟4，計(jì)算機(jī)(1)根據(jù)步驟3輸入的基因分子的熒光光強(qiáng)圖以及1/4波片(5)的旋轉(zhuǎn)角度計(jì)算得到基因分子的熒光光強(qiáng)圖的相位差和方位角；
步驟5，通過軟件將步驟4所得到的相位差、方位角值轉(zhuǎn)化形成灰度圖像，其中所成灰度圖像的每一個(gè)像素點(diǎn)的值代表相位差或方位角的大??；然后根據(jù)灰度圖像中像素值的大小賦予圖像不同色彩，像素值相同的區(qū)域賦予相同的顏色，像素值不同則顏色不同，從而形成擁有更高對比度的假彩圖像；
步驟6，根據(jù)步驟3得到的多幅基因分子的熒光光強(qiáng)圖以及步驟4得到的相位差、方位角，由通過系統(tǒng)各個(gè)偏振元件的mueller矩陣確定的stokes矢量表達(dá)式計(jì)算出s0、s1、s2和s3四個(gè)stokes參量，并使用步驟5中灰度圖轉(zhuǎn)換成假彩圖像的方法得到stokes參量的假彩圖像。
對獲得的圖像進(jìn)行處理，可以獲得分辨率較高的圖像。主要是采用了參數(shù)的非直觀算法，通過點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的瘦身，從而打破了分辨率的極限，從而獲得了較高的分辨率成像。非直觀算法的基本原理主要是利用光的偏振信息進(jìn)行成像，對于各向異性的樣品進(jìn)行成像，通過利用線性雙折射的物理模型，獲得多幅不同偏振態(tài)下的光強(qiáng)信息，通過光強(qiáng)表達(dá)式，可以通過利用計(jì)算傅里葉級數(shù)系數(shù)的方法，獲得我們所需要的參數(shù)，從而獲所需要的參數(shù)圖。
除了可以將計(jì)算出來的位相差，偏振方位角等參數(shù)進(jìn)行成像，還可以利用通過mueller矩陣計(jì)算出的stokes參量進(jìn)行參數(shù)成像，如下式所示：
式中，idp是像素點(diǎn)所在每幅圖的平均光強(qiáng)信息，δ是相位差，
綜上，本發(fā)明通過在普通的熒光顯微鏡的改造，增加了熒光非直觀光波參數(shù)成像的核心部件，通過多次測量不同偏振態(tài)下的光強(qiáng)圖，反演計(jì)算獲得分辨率比原光強(qiáng)圖更好的效果圖，同時(shí)由于非直觀算法對于散射光更加的敏感。相對于傳統(tǒng)的光學(xué)成像方法具有分辨率高的優(yōu)勢，相較于傳統(tǒng)基因檢測光學(xué)顯微成像器械具有成本低，速度快的優(yōu)勢。