本發(fā)明涉及醫(yī)藥檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及利用液質(zhì)聯(lián)用方法檢測(cè)和鑒定芍藥苷體內(nèi)代謝產(chǎn)物的方法。
背景技術(shù)：
：芍藥苷來(lái)源于芍藥科植物芍藥根、牡丹根、紫牡丹根，芍藥苷的分子式是c23h28o11，分子量為480，熔點(diǎn)196℃，具有擴(kuò)張血管、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、抗炎抗?jié)儭⒔鉄峤獐d、利尿的作用。關(guān)于中藥赤芍的研究與開(kāi)發(fā)已經(jīng)做了大量的工作，從研究?jī)?nèi)容看，以赤芍的化學(xué)成分、質(zhì)量控制及藥理作用機(jī)制研究為主，涉及赤芍中活性部位單萜苷類物質(zhì)的體內(nèi)代謝研究相對(duì)較少。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)赤芍和芍藥苷的體內(nèi)代謝做了研究，檢測(cè)和鑒定芍藥苷在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物從而根據(jù)代謝產(chǎn)物推測(cè)芍藥苷的體內(nèi)主要代謝類型為水解反應(yīng)、氧化反應(yīng)和結(jié)合反應(yīng)。藥物體內(nèi)代謝是研究藥物在生物體內(nèi)的吸收、分布、轉(zhuǎn)化和排泄等過(guò)程的特點(diǎn)和規(guī)律的一門科學(xué)，即藥物分子被機(jī)體吸收后，在機(jī)體作用下發(fā)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化。目前化學(xué)藥物的代謝研究已經(jīng)深入到藥物代謝酶的表達(dá)和調(diào)控以及利用體外研究預(yù)測(cè)藥物在體內(nèi)的相互作用階段。藥物經(jīng)合適的給藥途徑進(jìn)入機(jī)體后，在體內(nèi)發(fā)生一系列的變化，藥物體內(nèi)代謝主要是ⅰ相和ⅱ相反應(yīng)，ⅰ相反應(yīng)主要是官能團(tuán)反應(yīng)，ⅱ相反應(yīng)主要是結(jié)合反應(yīng)。藥物在體內(nèi)經(jīng)過(guò)一系列酶的代謝，很多酶除了催化藥物代謝也催化內(nèi)源性物質(zhì)的代謝，藥物和內(nèi)源性物質(zhì)的代謝有競(jìng)爭(zhēng)和干擾，因很多內(nèi)源性物質(zhì)在體內(nèi)不斷變化，故給體內(nèi)分析增加了一定的難度。我國(guó)擁有十分豐富的中草藥資源，所以研究中草藥在體內(nèi)轉(zhuǎn)化過(guò)程中母核結(jié)構(gòu)復(fù)雜易變的天然活性成分的藥物代謝，通過(guò)藥物的代謝轉(zhuǎn)化研究，認(rèn)識(shí)藥物在體內(nèi)的結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而了解藥物在體內(nèi)產(chǎn)生作用的分子形式，了解藥物的代謝機(jī)制，推測(cè)其作用靶點(diǎn)或作用方式具有重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有研究的空缺，提供利用液質(zhì)聯(lián)用方法檢測(cè)和鑒定芍藥苷體內(nèi)代謝產(chǎn)物的方法。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便、樣品處理簡(jiǎn)單、分析速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高，且可分析比較芍藥苷在體內(nèi)血液、尿液及糞便中的代謝情況，進(jìn)而進(jìn)行鑒定。本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種利用液質(zhì)聯(lián)用方法檢測(cè)芍藥苷體內(nèi)代謝產(chǎn)物的方法，包括以下步驟：灌胃給予主體芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，灌胃給藥兩天，給藥間隔為24h；收集樣品及進(jìn)行前處理；液質(zhì)聯(lián)用對(duì)收集的樣品進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。上述的一種利用液質(zhì)聯(lián)用方法檢測(cè)芍藥苷體內(nèi)代謝產(chǎn)物的方法，所述的收集樣品及進(jìn)行前處理包括收集尿樣樣品及進(jìn)行前處理、收集糞樣樣品及進(jìn)行前處理和收集血樣樣品及進(jìn)行前處理。上述的一種利用液質(zhì)聯(lián)用方法檢測(cè)芍藥苷體內(nèi)代謝產(chǎn)物的方法，所述的收集尿樣樣品及進(jìn)行前處理是：第一次灌胃給藥后24小時(shí)期間收集尿液，每次收集之后置-20℃冰箱保存，最終將收集到的尿液混合，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，加入甲醇溶液超聲提取，離心，取上清液，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，為尿樣樣品。上述的一種利用液質(zhì)聯(lián)用方法檢測(cè)芍藥苷體內(nèi)代謝產(chǎn)物的方法，所述的收集糞樣樣品及進(jìn)行前處理是：第一次灌胃給藥后24小時(shí)期間收集糞便，每次收集之后置-20℃冰箱保存，最終將收集到的糞樣混合，加入甲醇溶液超聲提取，濾紙濾過(guò)，離心，取上清液，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，為糞便樣品。上述的一種利用液質(zhì)聯(lián)用方法檢測(cè)芍藥苷體內(nèi)代謝產(chǎn)物的方法，所述的收集血樣樣品及進(jìn)行前處理是：第二次灌胃給藥后，在一定間隔時(shí)間內(nèi)分5次眼眶靜脈叢取血，置肝素化試管中，充分混勻，離心，取血漿，合并各組血漿，置-20℃冰箱中冷凍保存；將凍存血漿取出置于室溫下緩慢溶解，加入甲醇溶液沉淀蛋白，混勻振蕩1min，離心，吸取上清液，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，為血樣樣品。上述的一種利用液質(zhì)聯(lián)用方法檢測(cè)芍藥苷體內(nèi)代謝產(chǎn)物的方法，第二次灌胃給藥后，于0.5h，1h，2h，12h，18h分5次從眼眶靜脈叢取血。上述的一種利用液質(zhì)聯(lián)用方法檢測(cè)芍藥苷體內(nèi)代謝產(chǎn)物的方法，所述的主體是人體、鼠、兔、或狗。上述的一種利用液質(zhì)聯(lián)用方法檢測(cè)芍藥苷體內(nèi)代謝產(chǎn)物的方法，所述的液質(zhì)聯(lián)用對(duì)收集的樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件為：1)一級(jí)液質(zhì)條件：色譜條件：色譜柱：diamonsiltmodsc18；進(jìn)樣量：0.6μl；柱溫：30℃；流速：0.21ml/min；流動(dòng)相：乙腈(a)和含0.1％甲酸的水溶液(b)；色譜梯度如表1所示：表1時(shí)間(min)a(％)b(％)05954.859513.289215892211288332575426040481000521000質(zhì)譜條件：離子化模式：電噴霧電離負(fù)源模式；毛細(xì)管電壓為-3.5kv；霧化氣壓：5.0bar；霧化氣體：氮?dú)?；氣體流量：10.0ml/min；干燥溫度：200℃；質(zhì)量監(jiān)測(cè)范圍是100-1000m/z；2)二級(jí)液質(zhì)條件：色譜條件：色譜柱：diamonsiltmodsc18；進(jìn)樣量：2μl；柱溫：30℃；流速：0.21ml/min；流動(dòng)相：乙腈(a)和含0.1％甲酸的水溶液(b)；色譜梯度如表1所示。質(zhì)譜條件：離子化模式：電噴霧電離負(fù)源模式；毛細(xì)管電壓為-2.8kv；離子源溫度：110℃；脫溶劑溫度：300℃；碰撞能量：15ev-35ev；質(zhì)量監(jiān)測(cè)范圍：100-1000m/z；霧化氣體：氮?dú)?；氣體流量：1.50ml/min。本發(fā)明，用ms-dial軟件分別對(duì)所有樣品原始數(shù)據(jù)進(jìn)行讀取篩選以及總離子流和選擇離子色譜圖的檢識(shí)，篩選出新增加的色譜峰，即為代謝產(chǎn)物，并通過(guò)高分辨率的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合軟件推導(dǎo)出代謝物的分子式。通過(guò)軟件ms2analyzerver2.1對(duì)樣品中的母離子和子離子存在一些特定的中性丟失，對(duì)化合物結(jié)構(gòu)推導(dǎo)提供參考。用masslynxv4.1軟件對(duì)代謝產(chǎn)物二級(jí)離子碎片進(jìn)行讀取；利用化合物數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合上述軟件對(duì)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行推導(dǎo)，并利用文獻(xiàn)和cfm-id軟件對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行佐證。本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明采用對(duì)芍藥苷進(jìn)行大鼠體內(nèi)代謝，通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法對(duì)芍藥苷代謝產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，并比對(duì)芍藥苷在大鼠體內(nèi)血液、尿液和糞便中的代謝差異。結(jié)果表明：從芍藥苷代謝物中檢測(cè)到10個(gè)代謝物，10個(gè)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)已被確定，其中有4個(gè)是首次發(fā)現(xiàn)的新的代謝產(chǎn)物，有6個(gè)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。其中首次發(fā)現(xiàn)的新的芍藥苷代謝物是：在大鼠糞樣中發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)經(jīng)過(guò)水解去葡萄糖，水解開(kāi)環(huán)，脫苯甲酰基，還原反應(yīng)，再發(fā)生閉環(huán)反應(yīng)形成芍藥苷代謝素ⅱ(shuyz,hattorim,akaot,etal.metabolismofpaeoniflorinandrelatedcompoundsbyhumanintestinalbacteria.ii.:structuresof7s-and7r-paeonimetabolinesiandiiformedbybacteroidesfragilisandlactobacillusbrevis(pharmacognosy,chemical)[j].chemical&pharmaceuticalbulletin,1987,35:3726-3733.)，芍藥苷代謝素ⅱ被氧化，再與葡萄糖發(fā)生結(jié)合反應(yīng)形成代謝產(chǎn)物3，經(jīng)ms1和ms2質(zhì)譜分析確證，檢測(cè)到[m-h]-為377.1465，準(zhǔn)分子離子丟失一個(gè)氧生成m/z361碎片離子峰，碎片離子m/z253再脫掉2個(gè)co形成m/z197，確定代謝產(chǎn)物a3為氧化芍藥苷代謝素ii葡萄糖苷；本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了在芍藥苷中的新的代謝產(chǎn)物a2、a3、a7、a8，對(duì)芍藥苷在大鼠體內(nèi)代謝進(jìn)行更完整的表述；通過(guò)采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜及其綜合數(shù)據(jù)處理分析的方法，可以同時(shí)準(zhǔn)確定性多種芍藥苷體內(nèi)代謝產(chǎn)物。由于中藥成分在體內(nèi)代謝產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有復(fù)雜性的特點(diǎn)，本發(fā)明建立了一種根據(jù)已有信息重點(diǎn)分析具有藥物活性的單體化合物在體內(nèi)代謝情況的分析方法。通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)系統(tǒng)得到基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，利用液質(zhì)聯(lián)用分析數(shù)據(jù)的龐大，建立一種通過(guò)幾種數(shù)據(jù)處理軟件ms-dialms-dial、ms2analyzerver2.1、watersmasslynxv4.1等處理數(shù)據(jù)，再利用數(shù)據(jù)庫(kù)分析數(shù)據(jù)的綜合數(shù)據(jù)處理分析方法，可以準(zhǔn)確定性多種芍藥苷體內(nèi)代謝產(chǎn)物，從而從一定程度上解決了目前中藥成分分析領(lǐng)域中存在的很難根據(jù)所獲得的結(jié)構(gòu)信息準(zhǔn)確推測(cè)出各化合物的具體分子結(jié)構(gòu)的難題。通過(guò)比較芍藥苷單獨(dú)給藥后進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后的轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)化，進(jìn)而揭示芍藥苷的代謝過(guò)程，及體內(nèi)代謝特征，闡明赤芍作用機(jī)制及其科學(xué)內(nèi)涵、促進(jìn)赤芍新藥開(kāi)發(fā)和劑型改進(jìn)以及控制中醫(yī)的方藥理論均具有重要意義。本發(fā)明通過(guò)比較芍藥苷進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后的轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)化，進(jìn)而揭示芍藥苷的代謝過(guò)程，及體內(nèi)代謝特征，闡明赤芍作用機(jī)制及其科學(xué)內(nèi)涵、促進(jìn)赤芍新藥開(kāi)發(fā)和劑型改進(jìn)以及控制中醫(yī)的方藥理論均具有重要意義。附圖說(shuō)明圖1為芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品體外對(duì)照組溶液總離子流色譜圖。圖2為大鼠空白尿樣總離子流色譜圖。圖3為芍藥苷在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化的尿樣總離子流色譜圖。圖4為大鼠空白糞樣總離子流色譜圖。圖5為芍藥苷在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化的糞樣總離子流色譜圖。圖6為大鼠空白血漿樣總離子流色譜圖。圖7為芍藥苷在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化的血漿樣總離子流色譜圖。圖8-16分別為芍藥苷在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化的代謝產(chǎn)物a1-a10的提取離子色譜圖。圖17為芍藥苷在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化的代謝產(chǎn)物a1-a10的結(jié)構(gòu)式。圖18為芍藥苷在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化成代謝產(chǎn)物a3的途徑。具體實(shí)施方式實(shí)施例1利用液質(zhì)聯(lián)用方法檢測(cè)芍藥苷體內(nèi)代謝產(chǎn)物的方法，包括以下步驟：1)芍藥苷的制備將5kg赤芍藥材飲片粉碎，取250g，加入10倍量的70％乙醇，浸泡一夜，采用加熱回流方法對(duì)浸泡的赤芍提取，共提取三次，提取時(shí)間分別為2h，1h，1h。將提取液用三層紗布過(guò)濾藥渣，合并溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，隨后用正丁醇萃取三次，合并正丁醇萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到浸膏。然后采用色譜方法，包括吸附硅膠柱色譜、tlc、hplc、中壓制備液相等手段進(jìn)行分離得到芍藥苷，其結(jié)構(gòu)根據(jù)它們的光譜數(shù)據(jù)鑒定(uv,ir,ms,1h-nmr,13c-nmr)，經(jīng)hplc分析其純度大于98％。2)體外溶液和灌胃給藥溶液的制備芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：取芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品2.0g，用蒸餾水溶解，定容至10ml容量瓶中，搖勻，超聲溶解10min，即為0.20g/ml的芍藥苷供試品溶液，通過(guò)0.22μm微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾。灌胃溶液的制備：取適量芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水溶解，制成6.25mg/ml的芍藥苷灌胃液。3)動(dòng)物和給藥取12只健康sd大鼠，雄性，體重250g左右。禁食12h，期間自由飲水。隨機(jī)分為二組，每組6只，分別為空白對(duì)照組，芍藥苷給藥組。灌胃給藥兩天，給藥間隔為24h。芍藥苷給藥組劑量為50mg/kg大鼠(芍藥苷樣品濃度為6.25mg/ml，灌胃給藥2ml)，空白對(duì)照組給同樣體積的蒸餾水。4)樣品的采集和處理尿樣樣品的采集和處理：第一次灌胃給藥(包括芍藥苷組和空白對(duì)照組)后24小時(shí)期間收集尿液，每次收集之后置-20℃冰箱保存，最終將收集到的尿液混合，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃濃縮至干，加入20ml甲醇超聲提取30min，5000r/min離心15min，取上清液，過(guò)0.22μm微孔濾膜，為尿樣樣品，待液質(zhì)分析。糞樣樣品的采集和處理：第一次灌胃給藥(包括芍藥苷組和空白對(duì)照組)后24小時(shí)期間收集糞便，冷凍保存，加入20ml甲醇超聲提取20min，濾紙濾過(guò)，5000r/min離心10min，吸取上層溶液，過(guò)0.22μm濾膜，為糞樣樣品，待液質(zhì)分析。血樣樣品的采集和處理：第二次灌胃給藥(包括芍藥苷組和空白對(duì)照組)后，分別在給藥后0.5h，1h，2h，12h，18h分5次眼眶靜脈叢取血各1ml，置肝素化試管中，充分混勻，以5000r/min離心10min，取血漿，合并各組血漿，置-20℃冰箱中冷凍保存。將凍存血漿取出置于室溫下緩慢溶解，加入15ml甲醇沉淀蛋白，渦旋混合1min，以14000r/min離心15min，吸取上清液，以0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，為血樣樣品，待液質(zhì)分析。5)樣品檢測(cè)，液質(zhì)聯(lián)用對(duì)收集的樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件為：一級(jí)液質(zhì)條件：色譜條件：色譜柱：diamonsiltmodsc18；進(jìn)樣量：0.6μl；柱溫30℃；流速為0.21ml/min；流動(dòng)相：乙腈(a)和含0.1％甲酸的水溶液(b)；色譜梯度如表1所示：表1時(shí)間(min)a(％)b(％)05954.859513.289215892211288332575426040481000521000質(zhì)譜條件：離子化模式：電噴霧電離負(fù)源模式；毛細(xì)管電壓：-3.5kv；霧化氣壓：5.0bar；霧化氣體：氮?dú)?；氣體流量：10.0ml/min；干燥溫度：200℃；質(zhì)量監(jiān)測(cè)范圍是100-1000m/z。二級(jí)液質(zhì)條件：色譜條件：色譜柱：diamonsiltmodsc18；進(jìn)樣量：2μl；柱溫：30℃；流速：0.21ml/min；流動(dòng)相：乙腈(a)和含0.1％甲酸的水溶液(b)；色譜梯度如表1所示。質(zhì)譜條件：離子化模式：電噴霧電離負(fù)源模式；毛細(xì)管電壓：-2.8kv；離子源溫度：110℃；脫溶劑溫度：300℃；碰撞能量為15ev-35ev；質(zhì)量監(jiān)測(cè)范圍是100-1000m/z；霧化氣體：氮?dú)?；氣體流量：1.50ml/min。6)數(shù)據(jù)處理方法用ms-dial軟件分別對(duì)所有樣品原始數(shù)據(jù)進(jìn)行讀取、篩選以及總離子流和選擇離子色譜圖的檢識(shí)，篩選出新增加的色譜峰，即為代謝產(chǎn)物，并通過(guò)高分辨率的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合軟件推導(dǎo)出代謝物的分子式。通過(guò)軟件ms2analyzerver2.1對(duì)樣品中的母離子和子離子存在一些特定的中性丟失，對(duì)化合物結(jié)構(gòu)推導(dǎo)提供參考。用masslynxv4.1軟件對(duì)代謝產(chǎn)物二級(jí)離子碎片進(jìn)行讀??；利用化合物數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合上述軟件對(duì)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行推導(dǎo)，并利用文獻(xiàn)和cfm-id軟件對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行佐證。圖1為芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品體外溶液總離子流色譜圖，圖2為大鼠空白尿樣總離子流色譜圖，圖3為芍藥苷在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化的尿樣總離子流色譜圖，通過(guò)對(duì)比圖1和圖2，圖3可以看出，芍藥苷在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化后，在保留時(shí)間分別為6.70、7.90、8.58、12.60、14.48和27.33min均出現(xiàn)了新增加的峰。圖4為大鼠空白糞樣總離子流色譜圖，圖5為芍藥苷在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化的糞樣總離子流色譜圖，通過(guò)對(duì)比圖1和圖4，圖5可以看出，芍藥苷在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化后，在保留時(shí)間為6.70、7.13、8.58、14.48、18.37和26.77min出現(xiàn)了新增加的峰。圖6為大鼠空白血漿樣總離子流色譜圖，圖7為芍藥苷在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化的血漿樣總離子流色譜圖，同樣通過(guò)對(duì)比圖1，圖6和圖7可以看出，芍藥苷在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化后，在保留時(shí)間為4.26min出現(xiàn)了新增加的峰。對(duì)比圖1可以看出芍藥苷已經(jīng)完全轉(zhuǎn)化，即芍藥苷在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化后，通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法，得到了10個(gè)代謝產(chǎn)物；圖8-16分別為芍藥苷在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物a1-a10的提取離子色譜圖，可以看到在保留時(shí)間依次為4.26、6.70、7.13、7.90、8.58、12.60、14.48、18.37、26.77和27.33min的代謝物，并通過(guò)液質(zhì)二級(jí)碎片的推測(cè)，如圖17所示得到了代謝產(chǎn)物a1-a10的結(jié)構(gòu)。圖18為芍藥苷的代謝產(chǎn)物a3的代謝途徑示意圖。圖中看出，通過(guò)實(shí)施例1的方法可以測(cè)定并得到芍藥苷在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化的代謝產(chǎn)物。當(dāng)前第1頁(yè)12