本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2014年05月08日、申請(qǐng)?zhí)枮?01480035721.4、發(fā)明名稱為“癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)的拉曼定量方法”的申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

本發(fā)明涉及一種癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)的拉曼定量方法，其以伴隨癌的惡化而增加的血中的癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)、主要是游離dna為對(duì)象。

背景技術(shù)：

目前，作為癌的診斷方法之一，可使用檢測(cè)伴隨癌的惡化而在血液中出現(xiàn)、增加的癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)的方法。在此，癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)為從癌患者的體液中所提取的癌特有物質(zhì)，一般是指在癌化的細(xì)胞被破壞的情況下游離于血液中的、源自該被破壞的癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)等。而且，在現(xiàn)有的癌的診斷方法中，在血液中的癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)的定量值為某種一定值以上的情況下，判定為受驗(yàn)者存在患有癌的可能性。

作為因這樣癌化的細(xì)胞的破壞等而游離于血液中的癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)，已知有不僅蛋白質(zhì)、而且dna也同樣地游離。而且，報(bào)道有在健康人和癌患者中進(jìn)行比較時(shí)，就血液中的源自癌細(xì)胞的游離dna(ctdna)的量而言，與健康人相比，癌患者的一方顯著地多。因此，認(rèn)為通過(guò)將血液等的體液中的源自癌細(xì)胞的游離dna進(jìn)行定量，可以診斷受驗(yàn)者是否患有癌，作為這種癌的診斷方法，例如提出了：通過(guò)聚合酶連鎖反應(yīng)(pcr)法等擴(kuò)增的200bp以上的dna在被排出至體液或體外的糞便中等被檢出時(shí)，診斷為受驗(yàn)者存在患有癌的可能性，進(jìn)一步分析其dna的變異的方法(專利文獻(xiàn)1)；將體液等中所含的源自細(xì)胞殘?jiān)幕蚪Mdna進(jìn)行定量，在其值為某種一定值以上的情況下，進(jìn)一步進(jìn)行dna檢査的方法(專利文獻(xiàn)2)。

但是，即使通過(guò)診斷而判明患有癌，僅將體液中的dna進(jìn)行定量，還不能特定癌產(chǎn)生的臟器。而且，已知有在癌產(chǎn)生的情況下，根據(jù)其產(chǎn)生的臟器而產(chǎn)生特異的dna的變異。因此，通過(guò)明確dna的變異的種類，存在可以特定癌產(chǎn)生的臟器的可能性。在此，作為dna的變異，可列舉：dna的點(diǎn)突變、染色體的缺失或擴(kuò)增等結(jié)構(gòu)異常。例如，已知有胰腺癌的約7成在k-ras基因中產(chǎn)生點(diǎn)突變。另外，在異質(zhì)接合的缺失(lossofheterozygous、以下，簡(jiǎn)稱為loh)的分析中，也報(bào)道有在各癌種中特異的染色體臂的缺損，例如在肺癌中，已知有在3號(hào)染色體的短臂上loh集中。另外，在乳癌中，已知有8號(hào)染色體的長(zhǎng)臂的擴(kuò)增或rb2的擴(kuò)增。因此，為了提供將源自癌細(xì)胞的dna進(jìn)行定量而高精度地進(jìn)行癌的診斷的方法，提出了包含從受驗(yàn)者中采取的血漿提取游離dna的工序、將提取的游離dna進(jìn)行定量而算出每單位體積血漿的游離dna的工序、將算出的游離dna的算出值與第1閾值以上的第2閾值進(jìn)行比較的工序、和在算出值低于第1閾值的情況下，判定為受驗(yàn)者的患有癌可能性高，另一方面，第2閾值以上的情況下，源自正常細(xì)胞的dna混入于血漿中的癌的診斷方法(專利文獻(xiàn)3)。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1:美國(guó)專利第6143529號(hào)說(shuō)明書(shū)

專利文獻(xiàn)2:美國(guó)專利2004/0259101a1號(hào)說(shuō)明書(shū)

專利文獻(xiàn)3:國(guó)際公開(kāi)2008/090930號(hào)

專利文獻(xiàn)4:日本特開(kāi)2011-81001號(hào)公報(bào)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的課題

但是，例如即使將全血中的源自癌細(xì)胞的游離dna進(jìn)行定量，其量也為微量，與此相對(duì)，在全血中大量地含有源自作為正常細(xì)胞的淋巴細(xì)胞的dna。因此，即使從全血中直接提取dna，也難以將源自癌細(xì)胞的游離dna進(jìn)行定量。因此，例如考慮使用從全血中分離的血漿提取血漿中的源自癌細(xì)胞的游離dna并進(jìn)行定量的方法，但通過(guò)dna的提取方法，有時(shí)混入源自淋巴細(xì)胞等正常細(xì)胞的dna，有時(shí)將不是源自癌細(xì)胞的游離dna、而是將源自正常細(xì)胞的dna進(jìn)行定量，存在錯(cuò)誤診斷癌的可能性。因此，在癌的正確的診斷中，準(zhǔn)確地定量源自癌細(xì)胞的游離dna(本發(fā)明中稱為纏繞于組蛋白的dna)是重要的，如何簡(jiǎn)單迅速地提取微量的游離dna，如何除去源自正常細(xì)胞的dna并提高游離dna的檢測(cè)精度，如何精度好地檢測(cè)微量的dna，在癌的適當(dāng)?shù)脑\斷中為必需的。

另一方面，作為分析血中的微量dna的方法，有必要提供一種使用拉曼分光分析技法，定性及定量地檢測(cè)的手段，但sers現(xiàn)象不僅1)機(jī)制不能完美地理解，而且2)準(zhǔn)確地結(jié)構(gòu)性地被定義的納米物質(zhì)合成及控制困難、3)根據(jù)測(cè)定光譜時(shí)所使用的光的波長(zhǎng)、偏光方向引起的增強(qiáng)效率的變化等，在再現(xiàn)性及可靠性方面應(yīng)該解決的問(wèn)題較多，在以納米-生物傳感器的開(kāi)發(fā)及商用化為主的sers現(xiàn)象的應(yīng)用中作為大的課題殘留，提出了利用納米線和納米粒子的混合結(jié)構(gòu)，達(dá)到生物體提取物及蛋白質(zhì)、dna那樣的生物分子的sers信號(hào)的增強(qiáng)和測(cè)定的再現(xiàn)性、敏感度及可靠度提高的技術(shù)(專利文獻(xiàn)4)，但納米線和納米粒子的混合結(jié)構(gòu)經(jīng)由受體而使被測(cè)定對(duì)象吸附，因此，作為檢測(cè)微量的源自癌細(xì)胞的dna的方法不適合。

用于解決課題的技術(shù)方案

因此，本發(fā)明人等認(rèn)為作為檢測(cè)對(duì)象，不經(jīng)由受體而直接檢測(cè)容易發(fā)病癌或在發(fā)病時(shí)在血液中增加的癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)、例如源自癌細(xì)胞的游離dna為最完善的方案，并進(jìn)行了潛心研究。

在此，應(yīng)該檢測(cè)的對(duì)象的游離dna纏繞于相當(dāng)于絲卷的組蛋白這樣的蛋白質(zhì)，一個(gè)被纏繞的單元結(jié)構(gòu)(1組)稱為核小體，將核小體聚集而成為繩索狀的結(jié)構(gòu)稱為染色質(zhì)(纖維)。而且，細(xì)胞癌化而重復(fù)分裂時(shí)，為了不讓對(duì)癌增加不利的基因(癌抑制基因)出來(lái)，牢固地纏繞于組蛋白并封蓋，為了對(duì)組蛋白的纏繞方式更緊，使dna不能簡(jiǎn)單地解開(kāi)，引起甲基化的修飾，但通常組蛋白帶正電(+)，dna帶負(fù)電(－)，兩者如磁鐵那樣互相粘在一起，而且進(jìn)行甲基化而不能解開(kāi)，纏繞于組蛋白的dna帶有正電(+)(圖11(a)參照)。另一方面，由于乙?；瘞ж?fù)電(－)，因此，通常如果(+)正電的組蛋白進(jìn)行乙?；?，則彼此均帶負(fù)電(－)，與dna排斥。于是，成為dna這樣的“絲”從組蛋白中解開(kāi)而表達(dá)基因的機(jī)制(圖11(b)參照)。因此，為了選擇性地吸附源自癌細(xì)胞的游離dna，由于纏繞于組蛋白的dna帶有正電(+)，因此認(rèn)為優(yōu)選被吸附的基板帶有負(fù)電(－)。

另外，本發(fā)明人等將金屬絡(luò)合物水溶液在比形成絡(luò)合物的金屬低的電極電位(離子化傾向大的)金屬基板上利用電極電位差進(jìn)行化學(xué)還原而使量子晶體(納米尺寸的金屬絡(luò)合物晶體)凝集。在銀絡(luò)合物的情況下，通過(guò)使硫代硫酸銀水溶液在比銀低的電極電位(離子化傾向大的)的銅或銅合金上凝集，采用化學(xué)還原法而形成銀絡(luò)合物的量子晶體。

詳細(xì)而言，金屬絡(luò)合物的水溶液中的濃度應(yīng)該主要考慮形成的量子晶體的尺寸而確定，在使用分散劑時(shí)，也可考慮其濃度，通?？梢栽?00ppm～5000ppm的范圍內(nèi)使用，但也依賴于配體的功能，為了制備應(yīng)該稱為納米簇的納米尺寸，優(yōu)選500～2000ppm的濃度。形成量子晶體的金屬絡(luò)合物以具有與擔(dān)載金屬的電極電位e相關(guān)的式(i)所示的絡(luò)合物穩(wěn)定度常數(shù)(logβ)以上的方式選擇。

式(i)：e゜＝(rt/|z|f)ln(βi)

(其中，e゜表示標(biāo)準(zhǔn)電極電位，r表示氣體常數(shù)，t表示絕對(duì)溫度，z表示離子價(jià)，f表示法拉第常數(shù)。)

在此，金屬絡(luò)合物為選自au、ag、pt或pd中的等離子體金屬的絡(luò)合物的情況下，相對(duì)于拉曼光具有局部存在表面等離子體共振增強(qiáng)效果。特別是金屬絡(luò)合物為銀絡(luò)合物時(shí)，通過(guò)穩(wěn)定度常數(shù)(生成常數(shù))(logβi)為8以上的銀絡(luò)合劑和鹵化銀的反應(yīng)而形成即可，作為鹵化銀，優(yōu)選氯化銀，作為絡(luò)合劑，優(yōu)選為選自硫代硫酸鹽、硫代氰酸鹽、亞硫酸鹽、硫脲、碘化鉀、硫代水楊酸鹽、三聚硫氰酸鹽中的1種。銀絡(luò)合物具有由平均直徑為5～20nm的納米簇構(gòu)成的量子點(diǎn)，量子晶體的尺寸成為100～200nm。

將所述的銀絡(luò)合物在鹵離子的存在下進(jìn)行堿性處理(用次氯酸處理)時(shí)，通過(guò)以下的反應(yīng)而形成以銀鹵化物為核含有過(guò)氧化銀、銀氧化物的復(fù)合物的針狀納米晶體群(圖9)，而且發(fā)現(xiàn)：在水中帶有(－)荷電，另一方面，由于纏繞于組蛋白而dna帶有(+)荷電(圖11(a))，因此，選擇性地吸附以該游離dna為代表的帶有正電荷的癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)。而且發(fā)現(xiàn)：含有過(guò)氧化銀的銀氧化物的針狀納米晶體群通過(guò)激光的照射而被還原，析出金屬銀，因此，通過(guò)激光照射而顯示表面等離子體增強(qiáng)效果，可得到檢測(cè)以被吸附的游離dna為代表的癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)的表面增強(qiáng)拉曼散射(sers)。

na2s2o3+4naclo+h2o→na2so4+h2so4+4nacl

ag⁺+nacl→agcl+na⁺

ag⁺+3naocl→2agcl+naclo3+2na⁺

ag⁺+oh^－→agoh

2ag⁺+2oh→ag2o+h2o(參照美國(guó)專利第4478943號(hào))

本發(fā)明是基于上述見(jiàn)解而完成的，其以一種癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)測(cè)定用生物芯片為要點(diǎn)，所述癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)測(cè)定用生物芯片的特征在于，包含銀鹵化物或含有鹵素的銀氧化物的復(fù)合針狀納米晶體群，在水中顯示負(fù)電荷，可以吸附正電荷的癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)而形成電荷移動(dòng)絡(luò)合物，同時(shí)，可以通過(guò)光照射而析出銀粒子，具有通過(guò)激光照射可得到表面等離子體增強(qiáng)效果的區(qū)域。

發(fā)明效果

本發(fā)明的銀氧化物的復(fù)合針狀納米晶體群為含有過(guò)氧化銀的銀氧化物自組織化而形成神經(jīng)元狀的三維超結(jié)構(gòu)體(稱為介晶)的物質(zhì)(圖12及13)，可以使用ag/agcl電極對(duì)銀離子水溶液進(jìn)行定電位電析而形成，但可以通過(guò)將銀絡(luò)合物量子晶體、例如硫代硫酸銀量子晶體在鹵離子的存在下進(jìn)行堿性處理(用次氯酸鈉水溶液處理)而容易地形成。

另外，通過(guò)使用本發(fā)明的生物芯片，可以通過(guò)拉曼分析、用以下的方法定量血中所含的生物體試樣中的癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)、例如源自癌細(xì)胞的游離dna。即，通過(guò)準(zhǔn)備具有銀鹵化物或含有鹵素的銀氧化物的復(fù)合針狀納米晶體群、即含有過(guò)氧化銀的銀氧化物的介晶區(qū)域(圖12及13)的生物芯片，在該生物芯片的針狀納米晶體群區(qū)域中滴加血清或生物體試樣液，選擇性地吸附試樣中的具有正電荷的癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)，相對(duì)于吸附的癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)進(jìn)行激光照射而檢知來(lái)自其的拉曼散射光的工序，可以根據(jù)表面增強(qiáng)拉曼散射(sers)的強(qiáng)度判斷癌疾病。

作為血清中的癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)，包含在源自癌細(xì)胞的組蛋白中纏繞dna而成的dna(在此稱為游離dna)、其一個(gè)被纏繞的單元結(jié)構(gòu)(1組)的核小體成為聚集繩索狀的結(jié)構(gòu)的染色質(zhì)(纖維)。另外，含有帶有正電荷的球蛋白，但其增加與其它癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)相比，最大為2倍以下，因此，伴有本發(fā)明中所檢知的物質(zhì)的癌惡化的增加達(dá)到100倍以上，所以，表明檢知球蛋白以外的增加(源自癌細(xì)胞的游離dna)。另外，從正常細(xì)胞產(chǎn)生的dna、進(jìn)行乙?；M蛋白解離的dna、而且白蛋白占血清中的約60％，帶有負(fù)荷電，因此，在本發(fā)明中不被吸附。因此，癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)的定量檢査便利。

另外，認(rèn)為本發(fā)明的針狀納米晶體(含有過(guò)氧化銀的銀氧化物的介晶)的含有過(guò)氧化銀的銀氧化物在水溶液中容易帶負(fù)電荷，與試樣(靶分子)接觸而形成電荷移動(dòng)絡(luò)合物。進(jìn)而，銀氧化物接受光能量而被還原，析出金屬銀，因此，具有規(guī)則地排列的金屬納米粒子持有的表面等離子體共振增強(qiáng)效果。因此，本發(fā)明的針狀納米晶體(介晶)為非金屬，但兼?zhèn)浣饘傩再|(zhì)和離子化性質(zhì)，因此，可以提供適于表面增強(qiáng)拉曼散射(sers)測(cè)定用的生物芯片。

以形成量子晶體的金屬絡(luò)合物具有與擔(dān)載金屬的電極電位e相關(guān)的式(i)所示的絡(luò)合物穩(wěn)定度常數(shù)(logβ)以上的方式選擇形成量子晶體的金屬絡(luò)合物。

式(i)：e゜＝(rt/|z|f)ln(βi)

(其中，e゜表示標(biāo)準(zhǔn)電極電位，r表示氣體常數(shù)，t表示絕對(duì)溫度，z表示離子價(jià)，f表示法拉第常數(shù)。)

在本發(fā)明中，在金屬絡(luò)合物為選自au、ag、pt或pd中的等離子體金屬的絡(luò)合物的情況下，相對(duì)于拉曼光具有表面等離子體共振增強(qiáng)效果。

金屬絡(luò)合物為銀絡(luò)合物時(shí)，可通過(guò)穩(wěn)定度常數(shù)(生成常數(shù))(logβi)為8以上的銀絡(luò)合劑和鹵化銀的反應(yīng)形成。

作為鹵化銀，優(yōu)選氯化銀，作為絡(luò)合劑，優(yōu)選為選自硫代硫酸鹽、硫代氰酸鹽、亞硫酸鹽、硫脲、碘化鉀、硫代水楊酸鹽、三聚硫氰酸鹽中的1種。

銀絡(luò)合物具有由平均直徑為5～20nm的納米簇構(gòu)成的量子點(diǎn)，量子晶體的尺寸成為100～200nm。

金屬絡(luò)合物的水溶液中的濃度應(yīng)該主要考慮形成的量子晶體的尺寸而確定，在使用分散劑時(shí)，也可考慮其濃度。通常，可以在100ppm～5000ppm的范圍內(nèi)使用，但也依賴于配體的功能，為了制備應(yīng)該稱為納米簇的納米尺寸，優(yōu)選500～2000ppm的濃度。

在金屬基板或金屬粒子上所形成的量子晶體被認(rèn)為作為金屬絡(luò)合物晶體在水溶液中容易具有正極性，為了吸附固定生物體試樣中的蛋白質(zhì)，優(yōu)選在鹵離子的存在下進(jìn)行堿性處理、例如滴加ph11以上的次氯酸鈉水溶液并調(diào)整極性。量子晶體不僅進(jìn)行再結(jié)晶而在水溶液中成為負(fù)極性，而且銀氧化物的復(fù)合針狀納米晶體形成過(guò)氧化物，因此，可以促進(jìn)試樣中癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)的具有正電荷的源自癌細(xì)胞的游離dna的固定化。

生物體試樣中的總蛋白濃度的定量可以通過(guò)照射特定波長(zhǎng)的激光而得到拉曼光譜而得知。圖3為大腸癌患者的血清試樣，將其用純水稀釋為10倍、100倍、500倍、1000倍及一萬(wàn)倍而用633nm的激光(30mw)測(cè)定的拉曼光譜，與濃度同時(shí)峰上升值(psv)及峰積分值進(jìn)行變化。因此，得知可以進(jìn)行血清中的總蛋白質(zhì)的定量分析。特別可知：在碳特有的g(1300～1400cm^－1附近)及d帶(1550～1600cm^－1附近)中可看到峰，在甲基所特有的2900cm^－1附近也可以觀測(cè)峰。推測(cè)其表明在作為癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)的組蛋白上纏繞有dna的甲基化狀態(tài)下被檢測(cè)。

因此，可以由得到的拉曼光譜的峰高度、峰積分值、峰顯現(xiàn)時(shí)間等信息分析癌的鑒定及惡化狀態(tài)。圖1表示拉曼波形的峰算出法，可確認(rèn)人血清樣品的633nm激光形成的拉曼散射的光譜在1350cm^－1附近和1550cm^－1附近形成散射強(qiáng)度的峰。因此，將以800cm^－1(a)和2000cm^－1(b)的散射強(qiáng)度的平均值(m)為基準(zhǔn)的最大上升值(p-m)作為峰上升值(shiftingpeakvalue：psv)定義。另外，將峰整體的面積作為峰積分值定義。這些峰上升值及峰積分值在觀察人血清中的癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)方面是重要的，與峰顯現(xiàn)時(shí)間同時(shí)，可以設(shè)為表示癌的鑒定及惡化度的指標(biāo)。

附圖說(shuō)明

圖1表示拉曼波形的峰算出法，人血清樣品的633nm激光形成的拉曼散射的光譜表示在1350cm^－1附近和1550cm^－1附近形成散射強(qiáng)度的峰。

圖2a是制備了由胃癌患者12例得到的血清的試樣的拉曼光譜圖。

圖2b是制備了從大腸癌患者12例中得到的血清的試樣的拉曼光譜圖。

圖2c是制備了從良性疾病患者12例中得到的血清的試樣的拉曼光譜圖。

圖2d是表示胃癌、大腸癌、良性疾病試樣的拉曼散射峰上升值的比較的坐標(biāo)圖。

圖3是表示制備了從大腸癌患者12例中得到的血清的稀釋試樣和拉曼散射強(qiáng)度的關(guān)系的拉曼光譜，表示試樣濃度和散射強(qiáng)度峰上升值存在相關(guān)關(guān)系。

圖4是表示實(shí)施例1所示的新型sers基板制作法的步驟的說(shuō)明圖，左上的有限會(huì)社my-tech制基板為右邊的sem像所示的照片。

圖5是表示實(shí)施例1中制造的納米粒子凝集體(量子晶體)的各種sem像的照片。

圖6表示納米粒子的放大sem像。

圖7是表示在磷青銅板上滴加后的放置時(shí)間和量子晶體形狀的關(guān)系的照片。

圖8是表示量子晶體的eds光譜(元素分析)的結(jié)果的坐標(biāo)圖。

圖9是將量子晶體在鹵離子的存在下進(jìn)行堿處理(次氯酸處理)時(shí)的sem像。

圖10a是表示進(jìn)行堿處理的量子晶體中的針狀晶體的圖。

圖10b是表示橄欖球狀的塊的圖。

圖10c是表示大塊的eds光譜(元素分析)的結(jié)果的坐標(biāo)圖。

圖11是進(jìn)行了甲基化的游離dna(a)和進(jìn)行了乙?；膁na(b)的功能說(shuō)明圖。

圖12是表示將圖1的量子晶體基板在鹵離子的存在下進(jìn)行堿處理(次氯酸處理)時(shí)的再結(jié)晶基板的sem像(上圖)和再結(jié)晶基板的eds光譜(元素分析)的結(jié)果的坐標(biāo)圖(下圖)。

圖13表示進(jìn)行堿處理的再結(jié)晶基板的xps測(cè)定結(jié)果。

圖14表示蝕刻再結(jié)晶基板的表面之后的xps測(cè)定結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面，參照附圖，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式詳細(xì)地進(jìn)行說(shuō)明。

(實(shí)施例1)

如圖4所示，制備硫代硫酸銀1000ppm水溶液，將其1滴滴加于磷青銅板上，放置約3分鐘，驅(qū)散溶液時(shí)，制作右邊的sem像所示的量子晶體。

圖5是表示實(shí)施例1中制造的納米粒子凝集體(量子晶體)的各種sem像的照片，圖6表示納米粒子的放大sem像。其為100nm左右的薄的六角柱狀晶體，在表面顯現(xiàn)數(shù)nm級(jí)的凹凸。未確認(rèn)到金屬納米晶體所特有的小平面。

圖7是表示在磷青銅板上滴加后的放置時(shí)間和量子晶體形狀的關(guān)系的照片。首先，可看到生成六角形的量子晶體，一邊維持形狀一邊成長(zhǎng)。

圖8是表示量子晶體的eds光譜(元素分析)的結(jié)果的坐標(biāo)圖。在磷青銅板上所形成的晶體檢測(cè)到銀及源自絡(luò)合物配體的元素，但制備硫代硫酸銀1000ppm水溶液，在銅板上滴加其1滴，放置約3分鐘，驅(qū)散溶液的情況下，僅檢測(cè)到銀。

(量子晶體的制作的考察)

對(duì)于量子晶體而言，1000ppm硫代硫酸銀絡(luò)合物水溶液的情況下，滴加于磷青銅板上放置3分鐘時(shí)，形成為100nm左右的六角柱狀，由sem像確認(rèn)各六角柱狀的量子晶體具有數(shù)nm級(jí)的凹凸(圖4、圖5及圖6)，但未確認(rèn)到金屬納米晶體所特有的小平面，通過(guò)eds元素分析檢測(cè)到銀及源自絡(luò)合物配體的元素，因此，整體為銀絡(luò)合物的納米晶體，在其表面出現(xiàn)的凹凸推測(cè)是絡(luò)合物中的銀作為簇形成量子點(diǎn)而擴(kuò)展。本發(fā)明的銀絡(luò)合物量子晶體在磷青銅板上形成，另一方面，觀察在銅基板上僅銀的納米粒子析出的現(xiàn)象時(shí)，硫代硫酸銀絡(luò)合物的平衡電位為0.33，與銅的電極電位(0.34)同等，因此，在銅基板上僅銀(0.80)析出，磷青銅的情況下為0.22，電極電位稍微低，因此，認(rèn)為銀絡(luò)合物的晶體析出。因此，為了制作量子晶體，認(rèn)為以下條件是重要的：1)絡(luò)合物水溶液為500～2000ppm這樣的稀薄的區(qū)域、2)相對(duì)于金屬絡(luò)合物水溶液的平衡電位擔(dān)載金屬的電極電位稍微低、3)以電極電位差使金屬絡(luò)合物凝集。另外，使用1000ppm硫脲銀絡(luò)合物水溶液的情況也同樣。

(實(shí)施例2)

在實(shí)施例1中進(jìn)行了制備的磷青銅板上的硫代硫酸銀量子晶體基板上滴加ph11的次氯酸鈉水溶液，3分鐘后驅(qū)散水溶液，其后立即分別對(duì)將從胃癌患者12例中得到的血清純粹地稀釋10倍并進(jìn)行了制備的試樣、將從大腸癌患者12例中得到的血清純粹地稀釋10倍并進(jìn)行了制備的試樣及將從良性疾病患者12例中得到的血清純粹地稀釋10倍并進(jìn)行了制備的試樣照射633nm的激光，測(cè)定拉曼光譜。可以確認(rèn)在胃癌及大腸癌的惡化度和峰上升值及峰積分值之間看到相關(guān)關(guān)系。另外，胃癌的情況下，拉曼光譜在激光照射后1分鐘后，在拉曼光譜中顯現(xiàn)峰，大腸癌的情況下，在激光照射后2～3分鐘后，在拉曼光譜中顯現(xiàn)峰。另外，d是表示胃癌、大腸癌、良性疾病試樣的拉曼散射峰上升值的比較的坐標(biāo)圖。相對(duì)于良性疾病患者，可看到胃癌試樣及大腸癌試樣的峰顯著地高。胃癌試樣和大腸癌試樣可以說(shuō)在峰上升值中難以看到差異，但考慮峰顯現(xiàn)時(shí)間及峰積分值時(shí)，可以說(shuō)能夠鑒定兩種的癌。

(對(duì)銀氧化物的介晶的考察：其1)

在上述量子晶體基板上滴加5％次氯酸鈉水溶液并進(jìn)行2分鐘處理而除去時(shí)，可看到圖12所示的晶體結(jié)構(gòu)，可看到針狀的晶體和橄欖球狀的塊和大塊，因此，通過(guò)eds光譜(元素分析)分析各自的組成時(shí)，由以下的反應(yīng)式得知：認(rèn)為針狀的晶體由氯化銀和氧化銀的復(fù)合晶體構(gòu)成，但圖12的結(jié)果，不能確認(rèn)氯，銀和氧為主要。

na2s2o3+4naclo+h2o→na2so4+h2so4+4nacl(1)

ag⁺+nacl→agcl+na⁺(2)

ag⁺+3naocl→2agcl+naclo3+2na⁺(3)

ag++oh^－→agoh(4)

2ag⁺+2oh→ag2o+h2o(5)

因此，在本發(fā)明的介晶的形成中，認(rèn)為銀離子和硫代硫酸離子是在氯離子的存在下通過(guò)堿性氧化反應(yīng)而產(chǎn)生的，但在通常的水溶液中，僅形成氧化銀，由以下的xps測(cè)定推測(cè)：主要形成過(guò)氧化銀。

(對(duì)銀氧化物的介晶的考察：其2)

xps測(cè)定：

在上述量子晶體基板上滴加2分鐘次氯酸鈉水溶液25μl，制作再結(jié)晶基板，不蝕刻而直接用(使用機(jī)種：ulvac-phi(株)/phi5000versaprobeii(掃描型x射線光電子分光分析裝置))xps測(cè)定ag和o。另外，為了比較對(duì)象，測(cè)定氧化銀的粉和氯化銀的粉的ag。另一方面，將再結(jié)晶基板用氬氣簇離子槍蝕刻5分鐘而xps測(cè)定ag和o。由基于圖12的eds的結(jié)果推測(cè)圖13及圖14的xps測(cè)定結(jié)果時(shí)，可看到529ev附近的峰為源自過(guò)氧化銀(ago)的o峰，530ev附近的峰為源自氧化銀(ag2o)的o峰。在進(jìn)行蝕刻的情況下，氧量減少，但可以說(shuō)由于529ev附近的峰的源自過(guò)氧化銀(ago)的o峰比530ev附近的峰的源自氧化銀(ag2o)的o峰大，表明在基板附近形成過(guò)氧化銀。其推測(cè)為：介晶形成時(shí)的催化劑作用和基板的電極電位產(chǎn)生影響。

予以說(shuō)明，eds測(cè)定將上述再結(jié)晶基板采用使用機(jī)種：日本電子株式會(huì)社/jsm-7001f(電場(chǎng)放出型分析掃描電子顯微鏡)而進(jìn)行。

另外，即使將硫代硫酸銀的量子晶體用次氯酸水溶液、0.01當(dāng)量氫氧化鈉水溶液、0.01當(dāng)量鹽酸水溶液、0.1摩爾碳酸鈉水溶液進(jìn)行處理，不能得到同樣的結(jié)果。因此，認(rèn)為該針狀晶體的形成是在銀離子和硫代硫酸離子的存在下通過(guò)上述反應(yīng)而產(chǎn)生的。氧化銀在水溶液中帶有負(fù)電荷，利用光而被還原，使金屬銀析出。認(rèn)為過(guò)氧化銀由于其傾向顯著，因此吸附正電荷的癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)，而且可得到吸附的癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)和銀粒子之間的表面等離子體增強(qiáng)效果。

工業(yè)上的可利用性

因此，通過(guò)利用本發(fā)明，可以選擇性地檢測(cè)血及生物體試樣中的癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)，因此，可以進(jìn)行利用拉曼光譜的癌的早期發(fā)現(xiàn)、有關(guān)癌的惡化度的判定。