一種抗鏈球菌溶血素O檢測試劑盒及其制備方法與流程

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本發(fā)明涉及一種試劑盒及其制備方法，具體涉及一種抗鏈球菌溶血素o檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術：

免疫比濁法(turbidimetricinhibitionimmunoassay)是抗原抗體結合動態(tài)測定方法。其基本原理是：當抗原與抗體在特殊稀釋系統(tǒng)中反應而且比例合適(一般規(guī)定抗體過量)時，形成的可溶性免疫復合物在稀釋系統(tǒng)中的促聚劑(聚乙二醇等)的作用下，自液相析出，形成微粒，使反應液出現(xiàn)濁度。當抗體濃度固定時，形成的免疫復合物的量隨著檢樣中抗原量的增加而增加，反應液的濁度也隨之增加。通過測定反應液的濁度與一系列標準品對照，即可計算出檢樣中抗原的含量。

膠乳增強免疫比濁法即是將待測物質相對應的抗體/抗原包被在直徑為納米膠乳顆粒上，使抗原抗體結合物形成網狀結構，光通過之后，透射光和散射光的強度變化更為顯著，從而提高試驗的敏感性。

北京九強生物技術股份有限公司的專利公開了涉及膠乳致敏的方法及試劑(申請?zhí)?01010615283.2)，具體而言，所發(fā)明的膠乳致敏的方法為先通過化學鍵將膠乳與無關蛋白結合，再使用戊二醛將抗原或抗體交聯(lián)在無關蛋白上，從而使膠乳致敏。試劑二的制備過程需要兩次離心換液，不利于工業(yè)化制備。

寧波美康生物科技股份有限公司的專利公開了一種抗鏈球菌溶血素o抗體的檢測試劑盒(申請?zhí)?01410804871.9)。其所述蛋白膠乳顆粒復合物為組合蛋白標記在聚苯乙烯膠乳顆粒上形成的復合物；所述組合蛋白由鏈球菌溶血素o和惰性蛋白通過化學交聯(lián)而成。試劑二的制備過程需要一次超濾，兩次離心換液，費時費力。

天津醫(yī)科大學發(fā)明涉及一種帶有間隔臂的羧化聚苯乙烯微球上偶聯(lián)蛋白質的方法(申請?zhí)?01210005525.5)。其所述將偶聯(lián)了抗體的膠乳微球與殘余的抗體分離時采用了切向流過濾技術，克服了離心分離工藝中抗體易脫落和失活的缺點。

綜上，現(xiàn)有技術中的制備方法中為了達到去除過量組分、換緩沖液、改變ph值等目的均需要進行離心或超濾步驟，導致現(xiàn)有制備方法費時費力，不利于工業(yè)化。而且，現(xiàn)有技術記載的文件中引入了惰性蛋白或無關蛋白，該引入惰性蛋白或無關蛋白的過程繁瑣，且成功率低、效率低且耗時。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是：現(xiàn)有技術均需要用離心或超濾的步驟，費時費力，不利于工業(yè)化的問題，目的在于提供了一種抗鏈球菌溶血素o檢測試劑盒及其制備方法，其通過各個組分的投料范圍的優(yōu)化，能有效達到無需離心、超濾等去過量組分的步驟，使致敏后的膠乳直接作為試劑二參與反應，大大提高了常規(guī)膠乳增強免疫比濁試劑的制備效率，避免了耗時耗力的離心、超濾等純化過程。

本發(fā)明通過下述技術方案實現(xiàn)：

一種抗鏈球菌溶血素o檢測試劑盒，包括試劑二，該試劑二為采用膠乳、緩沖液、edc和hepes混合反應后，再加入naoh調節(jié)ph至7.00～8.00，最后再加入slo、封閉劑i和封閉劑ii后制成的成品；成品中各物質的濃度為：

本發(fā)明通過上述組分的優(yōu)化，能避免惰性蛋白或無關蛋白的引入，極大地簡化操作步驟。并且，本發(fā)明基于多個實驗，進而確定試劑二中各個組分的投料范圍，按本發(fā)明所建立的投料范圍進行投料則可以免去離心或超濾去除過量組分的目的，非常適用于產業(yè)化生產，提高生產效率，效果更加顯著。

進一步，所述緩沖液為mes-naoh溶液，所述封閉劑i為tween-20溶液，所述封閉劑ii為bsa溶液。更進一步，所述mes-naoh溶液的濃度為25～50mm，ph值為6.00；所述tween-20溶液的濃度為20％；所述bsa溶液的濃度為10％。

本發(fā)明通過本發(fā)明的范圍值的優(yōu)選設置，能在在簡化制備步驟的同時，有效提高檢測準確度。

優(yōu)選地，所述bsa溶液中還包含有3％的nan3。nan3的作用是防腐，添加入試劑二后終濃度變?yōu)?.03％，仍有防腐作用。

進一步，所述膠乳為帶間隔臂膠乳。鏈球菌溶血素o分子量約為69kd，分子量較小，經致敏至膠乳后，形成空間位阻，遮蓋被待測樣本中的抗體識別位點，不利于抗原決定簇的暴露，不易被待測樣本中的抗體所識別，反應效率低下。本發(fā)明同時可采用帶間隔臂的膠乳替換常規(guī)膠乳，該設置方式能夠有效降低抗原抗體結合的空間位阻問題，有利于抗原決定簇的暴露，從而被待測樣本中的抗體迅速識別，發(fā)生特異性凝集反應，達到較好的膠乳增強免疫比濁測定的效果。

本發(fā)明所述的百分數(shù)濃度均指w/v濃度，即質量/體積濃度，單位為g/ml。上述組分中edc為碳二亞胺，hepes為4-羥乙基哌嗪乙磺酸，slo為鏈球菌溶血素o，mes為2-嗎啉乙磺酸，bsa為牛血清白蛋白。

為保證稱量的準確性，edc添加的方式為：將edc配制成濃度為0.7～1.2％的edc溶液，edc溶液的用量為7.50ml/l～7.70ml/l。同時，本發(fā)明中所述naoh溶液的濃度優(yōu)選設置為20％。

一種抗鏈球菌溶血素o檢測試劑盒的制備方法，其中，試劑二的制備方法包括：

分別取膠乳、緩沖液、edc、hepes、slo、封閉劑i和封閉劑ii；配制edc溶液，配制naoh溶液；

將膠乳加入緩沖液中，再加入edc溶液進行活化，再加入hepes，用naoh溶液調節(jié)ph，加入slo進行化學交聯(lián)，然后加入封閉劑i和封閉劑ii進行封閉，最后制成成品。

進一步，所述edc溶液進行活化的時間為15min。所述化學交聯(lián)的時間為2h。所述封閉的時間為0.5h。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下的優(yōu)點和有益效果：

1、本發(fā)明控制過程非常精準嚴格，避免了常規(guī)膠乳致敏過程的離心、超濾等去雜過程，大大提高了常規(guī)膠乳增強免疫比濁試劑的制備效率，大大提高了生產效率；

2、本發(fā)明性能優(yōu)越，制備過程非常簡單、易行，大大節(jié)約了時間成本和人力成本，克服了現(xiàn)有技術的缺點。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚明白，下面結合實施例，對本發(fā)明作進一步的詳細說明，本發(fā)明的示意性實施方式及其說明僅用于解釋本發(fā)明，并不作為對本發(fā)明的限定。

實施例1

一種抗鏈球菌溶血素o檢測試劑盒，包括試劑一和試劑二，本實施例中，該試劑二中各物質的濃度為：

本實施例中該試劑二的膠乳優(yōu)選為帶間隔臂膠乳。

緩沖液優(yōu)選為濃度為25～50mm的mes-naoh溶液，其制備方法是：采用mes溶解后制成25～50mm濃度的溶液，然后采用naoh調節(jié)ph至6.0即制成mes-naoh溶液。封閉劑i優(yōu)選為濃度為20％的tween-20溶液。

封閉劑ii優(yōu)選為濃度為10％的bsa溶液，該bsa溶液中還含有3％的nan3；封閉劑ii的制備過程為：稱取10g的bsa和3g的nan3后，將兩者溶解到水中，并定容到100ml即制成bsa溶液。

以100ml為例，本實施例的試劑二的具體制備方法如下：

將naoh配制成濃度為20％的naoh溶液，將edc配制成濃度為0.9％的edc溶液；分別量取膠乳6ml、mes-naoh溶液14ml、edc溶液0.76ml、hepes0.5958g、slo7.6mg、tween-20溶液2ml和bsa溶液1ml；將hepes進行溶解。

將膠乳加入到緩沖液中，再加入edc溶液進行羧基的活化，活化時間為15min，再加入hepes，采用naoh溶液調節(jié)ph至7.60，加入slo進行化學交聯(lián)，化學交聯(lián)時間為2h，然后加入封閉劑i和封閉劑ii進行封閉，封閉時間為0.5h，最后定容到100ml即制成成品。

本實施例的試劑一為現(xiàn)有抗鏈球菌溶血素o檢測試劑盒中的試劑一，本實施例中提供了其中一種試劑一的組成，具體組成成份如下：

以1000ml為例，本實施例的試劑一的具體制備方法如下：

量取約800ml純化水，稱取并溶解hepes23.83g，用20％naoh調節(jié)ph值至7.00，稱取并溶解nacl9.00～15.00g，量取并溶解吐溫-2010.0ml，稱取并溶解peg600025.00～33.00g，量取并溶解防腐劑0.30ml，量取并溶解10％bsa10ml，最后定容到1000ml即制成成品。

實施例2

本實施例與實施例1的區(qū)別在于，本實施例中試劑二的制備的量不同，本實施例以500ml為例，本實施例的試劑二的具體制備方法如下：

分別量取膠乳30ml、緩沖液70ml、edc3.8ml、hepes2.9789g、slo38mg、封閉劑i10ml和封閉劑ii5ml；將edc配制成濃度為0.7～1.2％的edc溶液，將hepes進行溶解，將naoh配制成濃度為20％的naoh溶液；

將膠乳加入到緩沖液中，再加入edc溶液進行羧基的活化，活化時間為15min，再加入hepes，采用naoh溶液調節(jié)ph至7.40，加入slo進行化學交聯(lián)，化學交聯(lián)時間為2h，然后加入封閉劑i和封閉劑ii進行封閉，封閉時間為0.5h，最后定容到500ml即制成成品。

實施例3

本實施例與實施例1的區(qū)別在于，本實施例中試劑二制備方法不同，本實施例增加了離心的步驟，本實施例的具體設置如下：

分別量取膠乳6ml、緩沖液14ml、edc0.76ml、hepes0.5958g、slo7.6mg、封閉劑i2ml和封閉劑ii1ml；；將edc配制成濃度為0.7～1.2％的edc溶液；hepes溶解后采用naoh溶液調節(jié)ph值至7.50，獲得復溶液；

將膠乳加入到緩沖液中，再加入edc溶液進行羧基的活化，活化時間為15min，18000r/min離心15min，再加入ph值為7.50的復溶液進行復溶，加入slo進行化學交聯(lián)，化學交聯(lián)時間為2h，18000r/min離心15min，再加入ph值為7.50的復溶液進行復溶，再用然后加入封閉劑i和封閉劑ii進行封閉，封閉時間為0.5h，最后定容到100ml即制成成品。

采用上述實施例1-實施例3制成的試劑盒進行檢測，校準數(shù)據如表1所示，第三方質控測試結果如表2所示，采用40個樣本做臨床測試的檢測結果如表3所示。

表1

表2

表3

通過上述表1-表3的數(shù)據結果可以證明：本發(fā)明不經過離心、超濾等去雜過程，依然能有效使檢測結果十分準確。

實施例4

本實施例與實施例1的區(qū)別在于，本實施例中試劑二中各組分的添加量不同，本實施例中各組分的濃度低于本發(fā)明，本實施例的具體設置如下：

膠乳5.6ml、緩沖液14ml、edc溶液0.73ml、hepes0.5958g、slo7.2mg、封閉劑i2ml和封閉劑ii1ml；naoh調節(jié)溶液的ph值為6.90。

實施例5

本實施例與實施例1的區(qū)別在于，本實施例中試劑二中各組分的添加量不同，本實施例的具體設置如下：

膠乳5.9ml、緩沖液14ml、edc溶液0.755ml、hepes0.5958g、slo7.5mg、封閉劑i2ml和封閉劑ii1ml；naoh調節(jié)溶液的ph值為7.10。

實施例6