本發(fā)明屬于免疫診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種熒光定量檢測(cè)抑制素b（inhb）的免疫層析試紙條及其制備方法。
背景技術(shù)：
抑制素b(inhibinb,inh-b)是睪丸來(lái)源的糖蛋白激素，成年男性體內(nèi)血清抑制素b水平與fsh呈顯著負(fù)相關(guān)，對(duì)fsh起負(fù)反饋?zhàn)饔?。男性出生后不久，血清抑制素b水平逐漸上升，抑制素b與fsh之間一直維持負(fù)相關(guān)關(guān)系。20~30歲時(shí)，抑制素b水平到達(dá)高峰，此后抑制素b水平隨年齡增加逐漸降低。
生精功能低下與生精阻滯男性血清抑制素b水平顯著低于正常生精功能男性，唯支持細(xì)胞綜合征（sco）男性血清抑制素b水平極低，sco的發(fā)生與血清抑制素b的水平顯著相關(guān)，血清抑制素b的水平還與睪丸體積、精子總數(shù)顯著相關(guān)。抑制素b水平反映了整個(gè)睪丸組織的功能，是輸精管道的直接產(chǎn)物，成年男性血清中維持可檢測(cè)的抑制素b水平需要生精細(xì)胞的存在，因此抑制素b被認(rèn)為是男性精子發(fā)生的血清標(biāo)志物。血清抑制素b測(cè)定可用于評(píng)價(jià)男性不育病人的生精功能，兒童隱睪、性早熟的診斷，對(duì)非阻塞性無(wú)精子癥病人睪丸精子抽吸的預(yù)測(cè)，監(jiān)測(cè)放、化療對(duì)男性生精功能的損傷等。
目前臨床上inhb的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫法（elisa）、電化學(xué)發(fā)光法和化學(xué)發(fā)光法，這些方法都有各自的優(yōu)點(diǎn)和不足。elisa法檢測(cè)步驟多、耗時(shí)長(zhǎng)，操作過(guò)程的影響因素較多，易造成假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。因此目前逐步被化學(xué)發(fā)光法替代，但這類方法為全封閉系統(tǒng)，價(jià)格昂貴，需要專門培訓(xùn)儀器使用人員，維修及檢測(cè)成本高，并且不適合單人份和小批量檢測(cè)用，目前不利于inhb檢測(cè)在國(guó)內(nèi)的廣泛開(kāi)展。
鑒于目前尚無(wú)快速、準(zhǔn)確的定量檢測(cè)inhb的方法，本發(fā)明的目的是提供一種可用于快速定量檢測(cè)inhb的免疫層析試紙條，用于評(píng)估和監(jiān)測(cè)男性生精功能，所述試劑具有操作簡(jiǎn)單、方便快捷、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確定量等優(yōu)點(diǎn)，更適用于在各醫(yī)療機(jī)構(gòu)廣泛開(kāi)展。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種操作簡(jiǎn)單、方便快捷、經(jīng)濟(jì)、測(cè)定準(zhǔn)確的inhb檢測(cè)試紙條。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一種熒光定量檢測(cè)inhb的免疫層析試紙條，由樣品墊、標(biāo)記墊、包被膜、吸水紙順次搭接在pvc底板上構(gòu)成，所述標(biāo)記墊上噴涂有熒光微球標(biāo)記的inhb單克隆抗體和熒光微球標(biāo)記的親和素；所述包被膜包含檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述檢測(cè)線包被有與所述熒光微球標(biāo)記的inhb單克隆抗體處于不同表位的另一種inhb單克隆抗體。所述質(zhì)控線包被有特異性識(shí)別親和素的兔抗親和素抗體。
優(yōu)選地，所述熒光微球標(biāo)記的inhb單克隆抗體的濃度為0.1~1.0mg/ml，稀釋比例為5%~20%。所述熒光微球標(biāo)記的親和素的濃度為0.1~1.0mg/ml，稀釋比例為0.5%~5%。所述含熒光微球標(biāo)記的inhb單克隆抗體和熒光微球標(biāo)記的親和素的標(biāo)記墊處理液的噴量為3~6μl/cm。
優(yōu)選地，所述熒光微球的粒徑為100~500nm。所述熒光微球的激發(fā)波長(zhǎng)為310~550nm，發(fā)射波長(zhǎng)為340~620nm。
優(yōu)選地，所述包被膜檢測(cè)線上包被的inhb單克隆抗體的濃度為0.5~2mg/ml，噴量0.1~0.2μl/mm。所述質(zhì)控線上包被的兔抗親和素抗體的濃度為0.5~2mg/ml，噴量0.1~0.2μl/mm。
本發(fā)明還提供一種熒光定量檢測(cè)inhb的免疫層析試紙條的方法，包括以下步驟：
（1）熒光微球標(biāo)記蛋白的制備
取一定量的熒光微球，10000~15000rpm離心5~15分鐘，沉淀物用10~100mmph6.0~7.0磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)濃度為0.1%~1%，并超聲分散；加入終濃度為0.1~5mg/ml的碳二亞胺（edc），混勻，再加入終濃度為0.1~5mg/ml的n-羥基琥珀酰亞胺（nhs），混勻；室溫孵育20~40分鐘后10000~15000rpm離心5~15分鐘，沉淀物用10~100mmph6.0~7.0磷酸鹽緩沖液溶解。將復(fù)溶后的熒光微球超聲分散，按照0.1~1.0mg/ml熒光微球的比例分別加入inhb單克隆抗體和親和素，混勻后室溫旋轉(zhuǎn)混合反應(yīng)1.5~3小時(shí)，10000~15000rpm離心5~15分鐘，沉淀物用含10~40mm乙醇胺和0.05%-1%酪蛋白的tris-hcl（10~40mm，ph7.0-8.0）復(fù)溶，超聲分散后旋轉(zhuǎn)混合反應(yīng)0.5~1小時(shí)。10000~15000rpm離心5~15分鐘，沉淀用微球保存液復(fù)溶，2~8℃保存。
（2）樣品墊的預(yù)處理
將樣品墊用封閉液浸泡5分鐘后，置于濕度＜20%的40~50℃的烘箱，干燥12~24h后于2~30℃密封保存。所述封閉液含0.1~1%的tris，0.1~1%的tween20，0.1~1%的bsa，0.1~2%的pvp40，0.005~0.05%的鼠抗人紅細(xì)胞。
（3）標(biāo)記墊的制備
將熒光微球標(biāo)記的inhb單克隆抗體和熒光微球標(biāo)記的親和素分別按5%~20%和0.5%~5%的稀釋比例用標(biāo)記墊處理液噴涂在標(biāo)記墊上，噴量為3~6μl/cm。所述標(biāo)記墊處理液中含有0.2~2%的酪蛋白，5%~20%的海藻糖，0.1~1%的s9，0.1~0.5%的peg6000，0.02~0.05%的proclin300，0.01~0.05m、ph7.4的pbs緩沖液。將制備好的標(biāo)記墊置于濕度＜20%的40~50℃的烘箱，干燥12~24h后于2~30℃密封保存。
（4）包被膜的制備
分別將另一inhb單克隆抗體和兔抗親和素抗體用包被緩沖液調(diào)節(jié)濃度為0.5~2mg/ml，將inhb單克隆抗體噴到包被膜（3）上的檢測(cè)線，將兔抗親和素抗體噴到包被膜（3）上的質(zhì)控線，所述inhb單克隆抗體和兔抗親和素抗體的用量按膜包被液量均為0.1~0.2μl/mm，檢測(cè)線和質(zhì)控線間隔4~8mm，濕度＜20%的40~50℃的烘箱，干燥24~72h后于2~30℃密封保存，備用。
在底板上順次相互搭接地黏貼樣品墊、標(biāo)記墊、包被膜和吸水紙得到試紙板，按照切割要求切割成3~4mm寬度的試紙條。
本發(fā)明所述的inhb的免疫層析試紙條的檢測(cè)原理是雙抗體夾心法，樣本中的inhb抗原在層析作用下與標(biāo)記墊上熒光微球標(biāo)記的inhb抗體結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物在層析作用下移動(dòng)至包被膜的檢測(cè)線，在包被膜檢測(cè)線上包被有識(shí)別inhb抗原另一表位的抗體，形成雙抗體夾心復(fù)合物。復(fù)合物聚集在包被膜的檢測(cè)線處，受到光源激發(fā)釋放出相應(yīng)波長(zhǎng)的發(fā)射光，樣本中抗原濃度越高，檢測(cè)線發(fā)射光的強(qiáng)度越高，通過(guò)熒光檢測(cè)系統(tǒng)將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，以濃度點(diǎn)為橫坐標(biāo)，檢測(cè)線信號(hào)值比質(zhì)控線信號(hào)值（t/c）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而可準(zhǔn)確定量的計(jì)算出樣本中inhb的濃度。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有如下優(yōu)點(diǎn)：
本發(fā)明檢測(cè)線和質(zhì)控線采用獨(dú)立的反應(yīng)系統(tǒng)，互不干擾和影響，并采用t/c值的方式進(jìn)行定標(biāo)，保證了測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確度。
本發(fā)明采用熒光免疫層析法，該檢測(cè)方法靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、成本低。可檢測(cè)血液樣本中濃度低至10pg/ml的抑制素b，使用的檢測(cè)儀無(wú)需專業(yè)操作人員，15分鐘即可得到檢測(cè)結(jié)果。
本發(fā)明將熒光免疫層析技術(shù)引入inhb的檢測(cè)中，結(jié)合熒光檢測(cè)儀，實(shí)現(xiàn)inhb的單人份定量檢測(cè)，為臨床使用提供了極大的便利。
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明的熒光定量檢測(cè)inhb免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；
附圖標(biāo)記：1、樣品墊；2、標(biāo)記墊；3、包被膜；4、吸水紙；5、檢測(cè)線；6、質(zhì)控線；7、底板。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)描述，應(yīng)當(dāng)理解為，以下實(shí)施例是為了方便本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明方案的理解，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1
inhb熒光免疫層析試紙條的制備：
（1）熒光微球標(biāo)記蛋白的制備
取0.1ml10%熒光微球，15000rpm離心15分鐘，沉淀物用50mmph6.5磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)濃度為1%，并超聲分散；加入終濃度為2mg/ml的碳二亞胺（edc），混勻，再加入終濃度為5mg/ml的n-羥基琥珀酰亞胺（nhs），混勻；室溫孵育20分鐘后15000rpm離心15分鐘，沉淀物用50mmph6.5磷酸鹽緩沖液溶解。將復(fù)溶后的熒光微球超聲分散，并分兩管分別加入0.2mginhb單克隆抗體和0.1mg親和素，混勻后室溫旋轉(zhuǎn)混合反應(yīng)2小時(shí)，15000rpm離心15分鐘，沉淀物用含30mm乙醇胺和0.5%酪蛋白的tris-hcl（20mm，ph8.0）復(fù)溶，超聲分散后旋轉(zhuǎn)混合反應(yīng)1小時(shí)。15000rpm離心15分鐘，沉淀用微球保存液復(fù)溶，2~8℃保存。
（2）樣品墊的預(yù)處理
將樣品墊用封閉液浸泡5分鐘后，置于濕度＜20%的50℃的烘箱，干燥12h后于20~30℃密封保存。所述封閉液含0.05%的tris，1%的tween20，0.3%的bsa，0.5%的pvp40，0.03%的鼠抗人紅細(xì)胞。
（3）標(biāo)記墊的制備
將熒光微球標(biāo)記的inhb單克隆抗體和熒光微球標(biāo)記的親和素分別按10%和1%的稀釋比例用標(biāo)記墊處理液噴涂在標(biāo)記墊上，噴量為4μl/cm。所述標(biāo)記墊處理液中含有0.5%的酪蛋白，5%的海藻糖，0.5%的s9，0.3%的peg6000，0.03%的proclin300，0.05m、ph7.4的pbs緩沖液。將制備好的標(biāo)記墊置于濕度＜20%的50℃的烘箱，干燥24h后于20~30℃密封保存。
（4）包被膜的制備
分別將另一inhb單克隆抗體和兔抗親和素用包被緩沖液調(diào)節(jié)濃度為1.0mg/ml，將inhb單克隆抗體噴到包被膜（3）上的檢測(cè)線，將兔抗親和素抗體噴到包被膜（3）上的質(zhì)控線，所述inhb單克隆抗體和兔抗親和素抗體的用量按膜包被液量均為0.1μl/mm，檢測(cè)線和質(zhì)控線間隔4mm，濕度＜20%的50℃的烘箱，干燥72h后于20~30℃密封保存，備用。
（5）在底板上順次相互搭接地黏貼樣品墊、標(biāo)記墊、包被膜和吸水紙得到試紙板，按照切割要求切割成4mm寬度的試紙條。
實(shí)施例2
熒光免疫層析定量檢測(cè)血樣中抑制素b（inhb）的濃度
（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
將inhb抗原用陰性血漿配制成1600pg/ml、800pg/ml、400pg/ml、100pg/ml、50pg/ml、25pg/ml、0pg/ml，用同一批次的試劑，每個(gè)濃度點(diǎn)測(cè)試6次。以檢測(cè)線（t帶）、質(zhì)控線（c帶）的熒光強(qiáng)度比值為縱坐標(biāo)，inhb參考品濃度為橫坐標(biāo)，建立方程并擬合成標(biāo)準(zhǔn)曲線，將標(biāo)曲信息用燒錄軟件寫到id芯片中。
（2）樣品的檢測(cè)：
從試劑盒中取出檢測(cè)條，撕開(kāi)鋁箔袋包裝后，平放檢測(cè)條，平衡5分鐘，取100μl樣本加入加樣孔中，室溫避光反應(yīng)15分鐘。將id芯片插入熒光檢測(cè)儀，將檢測(cè)卡插入熒光儀插卡口，點(diǎn)擊“測(cè)試”，儀器通過(guò)分析軟件自動(dòng)計(jì)算出待測(cè)樣本中inhb的濃度。
（3）與深圳市亞輝龍抑制素b檢測(cè)試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）檢測(cè)的相關(guān)性比較。
采用本發(fā)明的試紙條與亞輝龍抑制素b檢測(cè)試劑盒對(duì)50例人血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果顯示，在本試紙條檢測(cè)范圍內(nèi)（10~1600pg/ml），兩種試劑的相關(guān)性r2＞0.95（y=1.059x+0.294）。
實(shí)施例3
請(qǐng)參照?qǐng)D1，一種熒光定量檢測(cè)amh的免疫層析試紙條，所述的免疫層析試紙條包括有pvc底板7，所述的pcv底板7上依次設(shè)有樣品墊1、標(biāo)記墊2、包被膜3、吸水紙4，所述的標(biāo)記墊2和所述的樣品墊1相接，所述的包被膜3和所述的標(biāo)記墊2相接，所述的吸水紙4和所述的包被膜3相接；所述標(biāo)記墊2上噴涂有熒光微球標(biāo)記的inhb單克隆抗體和熒光微球標(biāo)記的親和素；所述包被膜3上設(shè)有檢測(cè)線5和質(zhì)控線6，檢測(cè)線5和質(zhì)控線6間隔4~8mm，所述檢測(cè)線5包被有與所述熒光微球標(biāo)記的inhb單克隆抗體處于不同表位的另一種inhb單克隆抗體，所述質(zhì)控線6包被有特異性識(shí)別親和素的兔抗親和素抗體。
目前市面上inhb的檢測(cè)僅有適合醫(yī)院檢驗(yàn)科用于批量檢測(cè)的酶聯(lián)免疫法（elisa）、化學(xué)發(fā)光（clia）、電化學(xué)發(fā)光法，還沒(méi)有適合單人份、快速檢測(cè)、即時(shí)出結(jié)果的檢測(cè)試劑。本專利所述inhb檢測(cè)試劑在高靈敏檢測(cè)inhb的同時(shí)又能大大縮短檢測(cè)時(shí)間，為臨床檢驗(yàn)及使用帶來(lái)極大方便，更適合臨床科室操作。