本發(fā)明屬于免疫診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種熒光定量檢測促卵泡生成素（fsh）的免疫層析試紙條及其制備方法。
背景技術(shù)：
促卵泡生成素（fsh）是一種糖蛋白激素，帶有兩個亞基。α亞基類似于黃體生成素（lh）、人絨毛膜促性腺激素（hcg）以及促甲狀腺激素（tsh）的α亞基。β亞基不同于其他糖蛋白激素的β亞基，并顯示出其特殊的生物化學特性。
對于女性，fsh在下丘腦-垂體-卵巢調(diào)節(jié)環(huán)路中發(fā)揮作用，控制月經(jīng)周期。fsh和lh從垂體的促性腺細胞中陣發(fā)性釋放，血中的濃度由類固醇類激素通過下丘腦的負反饋機制控制。在卵巢中fsh和lh一起刺激卵泡的成熟，進而刺激卵泡中雌激素的生物合成。fsh水平在月經(jīng)周期的中期呈現(xiàn)一高峰，但不如lh明顯，由于卵巢功能的變化和雌激素水平的下降，絕經(jīng)期fsh達到高水平。fsh的水平會因絕經(jīng)期、閹割以及卵巢早衰的影響而上升。fsh和lh或fsh和雌激素濃度出現(xiàn)異常時，可能為神經(jīng)性厭食癥或多囊卵巢疾病。
對于男性，fsh能夠調(diào)節(jié)細精管的發(fā)育以及精子發(fā)生過程。與雌激素不同，雄性激素不能降低fsh的水平，男性體內(nèi)的fsh水平只受血清中l(wèi)h的調(diào)節(jié)。少精癥和無精子癥的患者通常會出現(xiàn)fsh升高，睪丸腫瘤患者血清的fsh濃度一般會下降，男性體內(nèi)出現(xiàn)高水平fsh時，可能為先天性睪丸發(fā)育不全或原發(fā)性睪丸衰竭。
目前臨床上fsh的檢測方法有酶聯(lián)免疫法（elisa）、化學發(fā)光法和膠體金免疫層析法等，這些方法都有各自的優(yōu)點和不足。elisa法檢測步驟多、耗時長，操作過程的影響因素較多，易造成假陽性和假陰性結(jié)果。因此目前逐步被化學發(fā)光法替代，但這類方法為全封閉系統(tǒng)，價格昂貴，需要專門培訓(xùn)儀器使用人員，維修及檢測成本高，并且不適合單人份和小批量檢測用，目前不利于fsh檢測在國內(nèi)的廣泛開展，膠體金法操作簡單、適合單人份檢測，但測試結(jié)果只能通過肉眼觀察，給出定性或半定量結(jié)果。
鑒于目前尚無快速、準確的定量檢測fsh的方法，本發(fā)明的目的是提供一種可用于快速定量檢測fsh的免疫層析試紙條，用于評估和監(jiān)測體內(nèi)促卵泡生成素的水平，所述試劑具有操作簡單、方便快捷、經(jīng)濟、準確定量等優(yōu)點，更適用于在各醫(yī)療機構(gòu)廣泛開展。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種操作簡單、方便快捷、經(jīng)濟、測定準確的fsh檢測試紙條。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一種熒光定量檢測fsh的免疫層析試紙條，由樣品墊、標記墊、包被膜、吸水紙順次搭接在pvc底板上構(gòu)成，所述的標記墊和所述的樣品墊相接，所述的包被膜和所述的標記墊相接，所述的吸水紙和所述的包被膜相接；所述標記墊上噴涂有熒光微球標記的fsh單克隆抗體和熒光微球標記的親和素；所述包被膜包含檢測線和質(zhì)控線，檢測線和質(zhì)控線間隔4~8mm，所述檢測線包被有與所述熒光微球標記的fsh單克隆抗體處于不同表位的另一種fsh單克隆抗體。所述質(zhì)控線包被有特異性識別親和素的兔抗親和素抗體。
優(yōu)選地，所述熒光微球標記的fsh單克隆抗體的濃度為0.1~1.0mg/ml，稀釋比例為5%~20%。
所述熒光微球標記的親和素的濃度為0.1~1.0mg/ml，稀釋比例為0.5%~5%。所述含熒光微球標記的fsh單克隆抗體和熒光微球標記的親和素的標記墊處理液的噴量為3~6μl/cm。
優(yōu)選地，所述熒光微球的粒徑為100~500nm。所述熒光微球的激發(fā)波長為310~550nm，發(fā)射波長為340~620nm。
優(yōu)選地，所述包被膜檢測線上包被的fsh單克隆抗體的濃度為0.5~2mg/ml，噴量0.1~0.2μl/mm。
所述質(zhì)控線上包被的兔抗親和素抗體的濃度為0.5~2mg/ml，噴量0.1~0.2μl/mm。
本發(fā)明還提供一種熒光定量檢測fsh的免疫層析試紙條的方法，包括以下步驟：
（1）熒光微球標記蛋白的制備
取一定量的熒光微球，10000~15000rpm第一次離心5~15分鐘，第一次離心得到的沉淀物用10~100mmph6.0~7.0磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)濃度為0.1%~1%，并超聲分散；加入終濃度為0.1~5mg/ml的碳二亞胺（edc），混勻，再加入終濃度為0.1~5mg/ml的n-羥基琥珀酰亞胺（nhs），混勻；室溫孵育20~40分鐘后10000~15000rpm第二次離心5~15分鐘，第二次離心分離得到沉淀物用10~100mmph6.0~7.0磷酸鹽緩沖液溶解。將復(fù)溶后的熒光微球超聲分散，按照0.1~1.0mg/ml熒光微球的比例分別加入fsh單克隆抗體和親和素，混勻后室溫旋轉(zhuǎn)混合反應(yīng)1.5~3小時，10000~15000rpm第三次離心5~15分鐘，第三次離心分離得到沉淀物用含10~40mm乙醇胺和0.05%-1%酪蛋白的tris-hcl（10~40mm，ph7.0-8.0）復(fù)溶，超聲分散后旋轉(zhuǎn)混合反應(yīng)0.5~1小時。10000~15000rpm第四次離心5~15分鐘，第四次離心分離得到的沉淀物用微球保存液復(fù)溶，2~8℃保存。
（2）樣品墊的預(yù)處理
將樣品墊用封閉液浸泡5分鐘后，置于濕度＜20%的40~50℃的烘箱，干燥12~24h后于2~30℃密封保存。所述封閉液含0.1~1%的tris，0.1~1%的tritonx-100，0.1~1%的bsa，0.1~2%的peg6000，0.005~0.05%的鼠抗人紅細胞。
（3）標記墊的制備
將熒光微球標記的fsh單克隆抗體和熒光微球標記的親和素分別按5%~20%和0.5%~5%的稀釋比例用標記墊處理液噴涂在標記墊上，噴量為3~6μl/cm。所述標記墊處理液中含有0.2~2%的酪蛋白，5%~20%的蔗糖，0.1~1%的tween-20，0.1~0.5%的peg20000，0.02~0.05%的proclin300，0.01~0.05m、ph8.0的tris-hcl緩沖液。將制備好的標記墊置于濕度＜20%的40~50℃的烘箱，干燥12~24h后于2~30℃密封保存。
（4）包被膜的制備
分別將另一fsh單克隆抗體和兔抗親和素用包被緩沖液調(diào)節(jié)濃度為0.5~2mg/ml，將fsh單克隆抗體噴到包被膜（3）上的檢測線，將兔抗親和素抗體噴到包被膜（3）上的質(zhì)控線，所述fsh單克隆抗體和兔抗親和素抗體的用量按膜包被液量均為0.1~0.2μl/mm，檢測線和質(zhì)控線間隔4~8mm，濕度＜20%的40~50℃的烘箱，干燥24~72h后于2~30℃密封保存，備用。
（5）在底板上順次相互搭接地黏貼樣品墊、標記墊、包被膜和吸水紙得到試紙板，按照切割要求切割成3~4mm寬度的試紙條。
本發(fā)明所述的fsh的免疫層析試紙條的檢測原理是雙抗體夾心法，樣本中的fsh抗原在層析作用下與標記墊上熒光微球標記的fsh抗體結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物在層析作用下移動至包被膜的檢測線，在包被膜檢測線上包被有識別fsh抗原另一表位的抗體，形成雙抗體夾心復(fù)合物。復(fù)合物聚集在包被膜的檢測線處，受到光源激發(fā)釋放出相應(yīng)波長的發(fā)射光，樣本中抗原濃度越高，檢測線發(fā)射光的強度越高，通過熒光檢測系統(tǒng)將光信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，以濃度點為橫坐標，檢測線信號值比質(zhì)控線信號值（t/c）為縱坐標繪制標準曲線，從而可準確定量的計算出樣本中fsh的濃度。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有如下優(yōu)點：
本發(fā)明檢測線和質(zhì)控線采用獨立的反應(yīng)系統(tǒng)，互不干擾和影響，并采用t/c值的方式進行定標，保證了測試結(jié)果的準確度。
本發(fā)明采用熒光免疫層析法，該檢測方法靈敏度高、操作簡單、成本低。一步法直接加樣，無需樣本稀釋液，可檢測血液樣本中濃度低至1.0miu/ml的促卵泡生成素，使用的檢測儀無需專業(yè)操作人員，15分鐘即可得到檢測結(jié)果。
本發(fā)明將熒光免疫層析技術(shù)引入fsh的檢測中，結(jié)合熒光檢測儀，實現(xiàn)fsh的單人份定量檢測，為臨床使用提供了極大的便利。
附圖說明
圖1為本發(fā)明的熒光定量檢測fsh免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；
附圖標記：1、樣品墊；2、標記墊；3、包被膜；4、吸水紙；5、檢測線；6、質(zhì)控線；7、底板。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進一步詳細描述，應(yīng)當理解為，以下實施例是為了方便本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明方案的理解，但不作為對本發(fā)明的限定。
實施例1
fsh熒光免疫層析試紙條的制備：
（1）熒光微球標記蛋白的制備
取0.1ml10%熒光微球，15000rpm離心15分鐘，沉淀物用50mmph6.5mes緩沖液調(diào)節(jié)濃度為1%，并超聲分散；加入終濃度為2mg/ml的碳二亞胺（edc），混勻，再加入終濃度為5mg/ml的n-羥基琥珀酰亞胺（nhs），混勻；室溫孵育20分鐘后15000rpm離心15分鐘，沉淀物用50mmph6.5mes緩沖液溶解。將復(fù)溶后的熒光微球超聲分散，并分兩管分別加入0.2mgfsh單克隆抗體和0.1mg親和素，混勻后室溫旋轉(zhuǎn)混合反應(yīng)2小時，15000rpm離心15分鐘，沉淀物用含30mm乙醇胺和0.5%酪蛋白的tris-hcl（20mm，ph8.0）復(fù)溶，超聲分散后旋轉(zhuǎn)混合反應(yīng)1小時。15000rpm離心15分鐘，沉淀用微球保存液復(fù)溶，2~8℃保存。
（2）樣品墊的預(yù)處理
將樣品墊用封閉液浸泡5分鐘后，置于濕度＜20%的50℃的烘箱，干燥12h后于20~30℃密封保存。所述封閉液含0.05%的tris，1%的tritonx-100，0.4%的bsa，0.5%的peg6000，0.02%的鼠抗人紅細胞。
（3）標記墊的制備
將熒光微球標記的fsh單克隆抗體和熒光微球標記的親和素分別按10%和1%的稀釋比例用標記墊處理液噴涂在標記墊上，噴量為4μl/cm。所述標記墊處理液中含有0.5%的酪蛋白，5%的蔗糖，0.5%的tween-20，0.3%的peg20000，0.03%的proclin300，0.05m、ph8.0的tris-hcl緩沖液。將制備好的標記墊置于濕度＜20%的50℃的烘箱，干燥24h后于20~30℃密封保存。
（4）包被膜的制備
分別將另一fsh單克隆抗體和兔抗親和素抗體用包被緩沖液調(diào)節(jié)濃度為1.5mg/ml，將fsh單克隆抗體噴到包被膜（3）上的檢測線，將兔抗親和素抗體噴到包被膜（3）上的質(zhì)控線，所述fsh單克隆抗體和兔抗親和素抗體的用量按膜包被液量均為0.15μl/mm，檢測線和質(zhì)控線間隔4mm，濕度＜20%的50℃的烘箱，干燥72h后于20~30℃密封保存，備用。
（5）在底板上順次相互搭接地黏貼樣品墊、標記墊、包被膜和吸水紙得到試紙板，按照切割要求切割成4mm寬度的試紙條。
實施例2
熒光免疫層析定量檢測血樣中促卵泡生成素（fsh）的濃度
（1）標準曲線繪制
將fsh抗原用陰性血漿配制成150miu/ml、75miu/ml、30miu/ml、15miu/ml、5miu/ml、1miu/ml、0miu/ml，用同一批次的試劑，每個濃度點測試6次。以檢測線（t帶）、質(zhì)控線（c帶）的熒光強度比值為縱坐標，fsh參考品濃度為橫坐標，建立方程并擬合成標準曲線，將標曲信息用燒錄軟件寫到id芯片中。
（2）樣品的檢測：
從試劑盒中取出檢測條，撕開鋁箔袋包裝后，平放檢測條，平衡5分鐘，取100μl樣本加入加樣孔中，室溫避光反應(yīng)15分鐘。將id芯片插入熒光檢測儀，將檢測卡插入熒光儀插卡口，點擊“測試”，儀器通過分析軟件自動計算出待測樣本中fsh的濃度。
（3）與羅氏促卵泡生成素檢測試劑盒（化學發(fā)光法）檢測的相關(guān)性比較。
采用本發(fā)明的試紙條與羅氏促卵泡生成素檢測試劑盒對50例人血清樣本進行檢測，測定結(jié)果顯示，在本試紙條檢測范圍內(nèi)（1~150miu/ml），兩種試劑的相關(guān)性r2＞0.95（y=0.969x+0.315）。
實施例3
請參照圖1，一種熒光定量檢測amh的免疫層析試紙條，所述的免疫層析試紙條包括有pvc底板7，所述的pcv底板7上依次設(shè)有樣品墊1、標記墊2、包被膜3、吸水紙4，所述的標記墊2和所述的樣品墊1相接，所述的包被膜3和所述的標記墊2相接，所述的吸水紙4和所述的包被膜3相接；所述標記墊2上噴涂有熒光微球標記的fsh單克隆抗體和熒光微球標記的親和素；所述包被膜3上設(shè)有檢測線5和質(zhì)控線6，檢測線5和質(zhì)控線6間隔4~8mm，所述檢測線5包被有與所述熒光微球標記的fsh單克隆抗體處于不同表位的另一種fsh單克隆抗體，所述質(zhì)控線6包被有特異性識別親和素的兔抗親和素抗體。
目前市面上fsh的檢測僅有適合醫(yī)院檢驗科用于批量檢測的酶聯(lián)免疫法（elisa）、化學發(fā)光（clia），還沒有適合單人份、快速檢測、即時出結(jié)果的定量檢測試劑。本專利所述fsh檢測試劑在高靈敏檢測fsh的同時又能大大縮短檢測時間，為臨床檢驗及使用帶來極大方便，更適合臨床科室操作。