本發(fā)明屬于水產(chǎn)品檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種改進quechers-前處理結(jié)合氣相色譜-電子轟擊離子化/質(zhì)譜(gc-ei/ms)檢測貝類中多溴聯(lián)苯醚的方法。

背景技術(shù)：

多溴聯(lián)苯醚(polybrominateddiphenylethers,pbdes)是一種溴系阻燃劑,廣泛用于電子產(chǎn)品、紡織等工業(yè)領(lǐng)域(wongmh,wusc,dengwj,etal.envirpollu,2007,149(2):131-140)。pbdes在生產(chǎn)、使用過程中易通過蒸發(fā)、滲漏等途徑進入環(huán)境，由于多溴聯(lián)苯醚分子結(jié)構(gòu)中存在p-π健、π-π健和共價鍵等穩(wěn)定作用力，其具有親脂性、持久性和生物累積性，在環(huán)境中難降解,屬于持久性有機污染物(nerissaw,thomash,olafp,etal.envscitec,2007,41(5):1584-1589)。2011年8月4日，歐洲食品安全局(efsa)通過歐盟委員會公布了食品中pbdes的污染情況報告，發(fā)現(xiàn)食品中的pbdes主要存在于養(yǎng)殖和捕撈的魚類及其他海洋生物體中，八種pbdes(bde-28，-47，-99，-100，-153，-154，-183和-209)在食品中的污染問題最為嚴(yán)重，稱為指示性單體。

目前國際上pbdes的分析方法主要有氣相色譜-負(fù)化學(xué)離子源/質(zhì)譜法(gc-nci/ms)、氣相色譜-電子轟擊離子化/質(zhì)譜法(gc-ei/ms)、氣相色譜-電子轟擊離子化/高分辨質(zhì)譜法(gc-ei/hrms)和氣相色譜-電子轟擊離子化/串聯(lián)質(zhì)譜法(gc-eims/ms)。其中，gc-ei/hrms和gc-eims/ms具有高的購置和維護成本，普及率低，難以推廣；gc-nci/ms雖然具有高的特異性和靈敏度，但該方法只是針對特征離子br^–檢測，除了不能消除樣品基質(zhì)中所存在的共流br^–離子干擾外，還限制了同位素稀釋方法的使用；gc-ei/ms方法普及率高，結(jié)合薄液膜、短柱長的毛細(xì)管柱可以解決高溴代低響應(yīng)的問題，同時對低溴代靈敏度較高，可以滿足環(huán)境及生物樣品中多種pbdes的快速檢測，適合開展相關(guān)工作。

pbdes在環(huán)境介質(zhì)以及生物體中分布范圍廣泛，同時存在著多種同系物，因此對樣品的前處理方法提出了較高要求。目前研究的前處理方法主要有索氏提取法、液液萃取法等傳統(tǒng)方法，以及加速溶劑萃取法和超聲波輔助提取法等新型提取方法，提取效率相對較高。但生物體等基質(zhì)復(fù)雜、干擾較大，需要結(jié)合中性al2o3、中性硅膠、堿性硅膠、酸性硅膠等多層凈化材料或填充柱(李敏潔,金芬,楊莉莉等，分析化學(xué)，2014,42(9)：1288-1294)，才能實現(xiàn)提取液的較好凈化。且凈化材料制備程序復(fù)雜、成本較高。

目前，針對生物樣品中多溴聯(lián)苯醚的現(xiàn)有檢測方法，常需要凝膠滲透色譜柱(gpc)、硅膠柱或氧化鋁柱等進行純化，前處理耗時費力、成本較高。且檢測用常規(guī)毛細(xì)管柱對高溴代聯(lián)苯醚尤其是bde-209的保留較強，靈敏度較低，與多種低溴代同系物難以同時檢測。gc-nci/ms檢測方法存在基質(zhì)干擾問題，另外高分辨質(zhì)譜較難操作、普及率低。針對以上問題，本發(fā)明選擇八種指示性多溴聯(lián)苯醚(bde-28，-47，-99，-100，-153，-154，-183和-209)作為研究對象，采用正己烷-丙酮混合有機相提取，無水硫酸鈉干燥、新型油脂凈化粉(emr-lipid)改進的quechers技術(shù)，并結(jié)合濃硫酸氧化凈化，實現(xiàn)了貝類中多溴聯(lián)苯醚的高效前處理。并選用短柱長、薄液膜的毛細(xì)管柱(db-5ms,15m×0.25mm×0.10μm)，結(jié)合氣相色譜-電子轟擊離子化/質(zhì)譜法(gc-ei/ms)，提高檢測靈敏度，實現(xiàn)了貝類樣品中低溴代及高溴代聯(lián)苯醚的同時快速定性和定量分析。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測貝類中多溴聯(lián)苯醚殘留量的方法。

為達(dá)到以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：

6890-5973氣質(zhì)聯(lián)用儀(安捷倫公司，美國)。talboys型旋渦混合器(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)，bt224s分析天平(sartorius公司，法國)，n-evap^tm112型氮氣吹掃儀(organomation公司，美國)，milli－q型超純水儀(millipore公司，美國)。

bde混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(溶劑為異辛烷)，包括美國環(huán)境保護署(epa)1614草案中優(yōu)先關(guān)注的8種bde單體：bde-28(2,4,4'-三溴聯(lián)苯醚)、bde-47(2,2',4,4'-四溴聯(lián)苯醚)、bde-100(2,2',4,4',6-五溴聯(lián)苯醚)、bde-99(2,2',4,4',5-五溴聯(lián)苯醚)、bde-154(2,2',4,4',5,6'-六溴聯(lián)苯醚)、bde-153(2,2',4,4',5,5'-六溴聯(lián)苯醚)、bde-183(2,2',3,4,4',5',6-七溴聯(lián)苯醚)和bde-209(十溴聯(lián)苯醚)。其中bde-209質(zhì)量濃度為200μg/ml，其余單體的質(zhì)量濃度均為20μg/ml。內(nèi)標(biāo)物：pcb209(2,2',3,3',4,4',5,5',6,6'-十氯聯(lián)苯)。以上藥品均購于美國accustandard公司。quechersdspeemr-lipid凈化粉(agilent公司)，正己烷、丙酮(hplc級，merk公司)，其他試劑皆為分析純。

混標(biāo)使用液：準(zhǔn)確吸取一定量bde混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用異辛烷稀釋配成1μg/ml(bde-209為10μg/ml)的混合溶液，避光4℃冷藏保存。

氣相條件：db-5ms色譜柱(15m×0.25mm×0.10μm)；進樣量:1μl；進樣口：300℃；載氣：he氣，載氣流速1.0ml/min；程升程序：90℃保持1min，10℃/min速率升溫至330℃，保持5min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊源(ei)，選擇離子掃描模式(srm)；電離電壓為70ev；接口溫度為300℃，離子源溫度為150℃。其他相關(guān)質(zhì)譜條件見表1。

表1多溴聯(lián)苯醚相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)

注：*定量離子

具體方法：

將水產(chǎn)樣品取可食部分勻漿，冷凍干燥后用研缽研碎，稱取試樣20g(精確到0.01g)，置于50ml具塞離心管中，加入內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液；同時加入10mlh2o，2gnacl，20ml正己烷-丙酮溶液(1:1)渦旋萃取10min，4000r/min離心5min，將提取液轉(zhuǎn)移至另一50ml離心管。再加入20ml正己烷-丙酮溶液(1：1)重復(fù)提取一次，合并提取液于同一離心管中。

之后進行以下步驟：

向上述提取液中加入5g無水硫酸鈉、2gemr-lipid凈化粉。渦旋2min后4000r/min離心5min，上清液氮氣吹干(40℃以內(nèi))。之后將上述樣品用1ml正己烷溶解后至5ml離心管，加入200ul濃硫酸，渦旋離心后取上清液(8000r/min,5min)至另一5ml離心管，加入1ml2％na2so4水溶液清洗，上清液氮氣吹干后，0.5ml異辛烷定容，供氣相色譜-質(zhì)譜儀測定。

本發(fā)明選擇八種指示性多溴聯(lián)苯醚(bde-28，-47，-99，-100，-153，-154，-183和-209)作為研究對象，采用正己烷-丙酮混合有機相提取，無水硫酸鈉干燥、新型油脂凈化粉(emr-lipid)改進的quechers技術(shù)，并結(jié)合濃硫酸氧化凈化，實現(xiàn)了貝類中多溴聯(lián)苯醚的高效前處理。選用薄液膜的毛細(xì)管柱(db-5ms,15m×0.25mm×0.10μm)，結(jié)合氣相色譜-電子轟擊離子化/質(zhì)譜法(gc-ei/ms)，實現(xiàn)了水產(chǎn)樣品中低溴代及高溴代聯(lián)苯醚的同時快速定性和定量分析。

本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢：

1)本發(fā)明將新型油脂凈化粉(emr-lipid)用于貝類中多溴聯(lián)苯醚分散固相萃取的前處理中，通過改進的quechers技術(shù)，可實現(xiàn)樣品中脂肪類的大量、快速去除。對比使用酸性硅膠粉、硅膠粉和中性氧化鋁粉等復(fù)合材料的凈化效果，發(fā)現(xiàn)emr-lipid凈化粉效果更佳，且不需要提前制備，操作簡單，成本較低。2)對于基質(zhì)復(fù)雜樣品，進一步結(jié)合濃硫酸氧化凈化技術(shù)，更好的降低基質(zhì)干擾，并極大的提高了檢測效率。3)選用短柱長、薄液膜的毛細(xì)管柱(db-5ms,15m×0.25mm×0.10μm)，結(jié)合氣相色譜-電子轟擊離子化/質(zhì)譜法(gc-ei/ms)，實現(xiàn)了水產(chǎn)樣品中低溴代及高溴代聯(lián)苯醚的同時快速定性和定量分析。

附圖說明

圖1為本發(fā)明具體實施方式中標(biāo)準(zhǔn)溶液的tic圖；

(bde-209為1.0μg/ml，其他bde為100ng/ml)

圖2為本發(fā)明具體實施方式中凈化效果的色譜圖比較；

其中：a：2g酸性硅膠粉+1g硅膠粉+2g中性氧化鋁粉；b：2gemr-lipid凈化粉；

圖3為本發(fā)明實施例中空白和貝類加標(biāo)樣品的提取離子色譜圖(srm)；

其中：a：空白貝類樣品；b：貝類加標(biāo)樣品(bde-209為50ug/kg，其他為5.0ug/kg)。

具體實施方式

在優(yōu)化實驗條件下，用異辛烷配置系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。8種多溴聯(lián)苯醚類皆以pcb-209為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，內(nèi)標(biāo)法定量。表2為8種多溴聯(lián)苯醚類在對應(yīng)范圍內(nèi)的線性關(guān)系，以及通過向空白貝類樣品(青島膠州灣貝類養(yǎng)殖區(qū)采集的扇貝樣品，樣品采用說明書發(fā)明內(nèi)容部分的技術(shù)方案進行處理)中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液得到方法的回收率和靈敏度?？瞻缀图訕?biāo)樣品的選擇離子掃描(srm)見圖3。

表2貝類樣品中多溴聯(lián)苯醚類添加回收實驗(n＝6)

結(jié)果表明，本發(fā)明方法具有較高的靈敏度，8種多溴聯(lián)苯醚類的最低檢出限(lod)為0.025μg/kg(s/n>3，bde-209為0.25μg/kg)，定量限(lod)為0.08μg/kg(s/n>10，bde-209為0.80μg/kg)，同時選用三個不同濃度的加標(biāo)實驗，回收率在80.0％～120％之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差皆小于10％，說明方法的準(zhǔn)確性和靈敏度較高，重現(xiàn)性好，且方法操作簡便、高效，易于普及，適合于水產(chǎn)樣品中多溴聯(lián)苯醚類殘留的同時檢測。

在其他方案與說明書中技術(shù)方案相同的情況下，將2gemr-lipid凈化粉替換成本領(lǐng)域常用的2g酸性硅膠粉+1g硅膠粉+2g中性氧化鋁粉，結(jié)果如圖2所示(僅展示bde-153和bde-154的結(jié)果)，結(jié)果顯示，本發(fā)明使用emr-lipid凈化粉不但效果更佳(顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的方法)，而且不需要提前制備，操作簡單。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍。