本發(fā)明涉及柱色譜法，特別涉及一種款冬花液相指紋圖譜的構(gòu)建方法及其在質(zhì)量檢測中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

款冬花為我國傳統(tǒng)中藥材，具有潤肺下氣，止咳化痰的功效，含有苯丙素類、萜類、黃酮類、甾體類、生物堿、揮發(fā)油等成分?，F(xiàn)行的《中國藥典》對款冬花質(zhì)量控制方法較為簡單，僅以款冬酮含量作為藥材質(zhì)量評價的單一指標(biāo)，而單一指標(biāo)的測定難以真正從整體上反映藥材質(zhì)量。

指紋圖譜技術(shù)作為一種多組分化學(xué)成分樣品的有效質(zhì)量控制方法，能夠從整體上反映出待測樣品的整體性、特征性，目前被廣泛應(yīng)用于中草藥的質(zhì)量控制。王福剛等(蜜炙款冬花hplc指紋圖譜研究，中藥材,第35卷第1期,2012)對蜜炙款冬花指紋圖譜進(jìn)行了研究，共確定13個共有峰，但僅指認(rèn)了蘆??；楊秀偉等(款冬花藥材的hplc化學(xué)成分指紋圖譜研究，藥學(xué)學(xué)報,第44卷第5期,2009)建立了款冬花藥材的化學(xué)成分指紋圖譜，確定25個共有峰，但是所指認(rèn)的16個特征峰中酚酸類成分較少，而這類成分與款冬花止咳祛痰作用密切相關(guān)。所以，為了準(zhǔn)確評價款冬花藥材質(zhì)量，需要建立一種能全面反映包括酚酸類成分在內(nèi)的指紋圖譜。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種能全面反映酚酸類成分的款冬花液相指紋圖譜的構(gòu)建方法及其在質(zhì)量檢測方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種款冬花液相指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)測試溶液的制備：取款冬花粉末0.8-1.2g，加入75％甲醇20-25ml，超聲提取0.5-1h，以75％甲醇補足損失重量，溶液過0.22μm微孔濾膜即可；

(2)吸取測試溶液至高效液相色譜儀測定，得到化學(xué)指紋圖譜；所述液相色譜條件：

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；柱溫：25℃-35℃；進(jìn)樣量：1-20μl；流速：0.8-1.2ml/min；紫外檢測波長：0-42min以240-326nm檢測；42-80min以210-230nm檢測；流動相：a相為0.01％-0.1％甲酸乙腈，b相為0.01％-0.1％甲酸水溶液，梯度洗脫，每1次進(jìn)樣完成后，系統(tǒng)平衡5min后再次進(jìn)樣。

所述步驟(1)中取款冬花粉末1.0g，加入75％甲醇為20ml，超聲提取時間為1h。

所述步驟(2)中液相色譜條件為：柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μl；流速：1ml/min；流動相：a相：0.03％甲酸乙腈，b相：0.03％甲酸水溶液。

所述步驟(2)中檢測波長：254nm/220nm切換檢測；所述指紋圖譜有14個特征峰，以12號峰為參照峰，相對保留時間：

1號峰：0.22±0.07；2號峰：0.26±0.03；3號峰：0.27±0.10；4號峰：0.41±0.01；5號峰：0.44±0.02；6號峰：0.48±0.16；7號峰：0.50±0.08；8號峰：0.53±0.10；9號峰：0.73±0.03；10號峰：0.74±0.17；11號峰：0.78±0.01；13號峰：1.23±0.13；14號峰：1.40±0.09。

所選的14個特征峰所對應(yīng)的化合物分別是：

1號峰：新綠原酸；2號峰：綠原酸；3號峰：隱綠原酸；4號峰：蘆??；5號峰：金絲桃苷；6號峰：異綠原酸b；7號峰：異綠原酸a；8號峰：異綠原酸c；9號峰：槲皮素；10號峰：山奈酚；11號峰：色原酮；12號峰：款冬酮；13號峰：1β,8-bisangeloyloxy-3β,4β-epoxybisabola-7(14),10-diene；14號峰：款冬素酯。

所述步驟(2)中梯度洗脫條件：0-2min，5％a相；2-7min，5％-15％a相；7-35min，15％-30％a相；35-38min，30％-55％a相；38-45min，55％-75％a相；45-65min，75％-80％a相；65-80min，80％-95％a相。

本發(fā)明的優(yōu)點如下：

本發(fā)明所建立的款冬花指紋圖譜與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點和效果：1.樣本前處理簡單、重現(xiàn)性好；2.通過雙波長切換可以更靈敏的檢測款冬花中不同類型的成分；3.本研究所建立的款冬花指紋圖譜特征峰均得到結(jié)構(gòu)指認(rèn)，可同時檢測6種酚酸類成分，更準(zhǔn)確的評價款冬花的藥材質(zhì)量。

附圖說明

圖1為不同流動相條件下款冬花指紋圖譜對比

圖2為不同檢測波長下款冬花指紋圖譜對比

圖3為款冬花液相指紋圖譜，圖中1-10號特征峰在紫外254nm下檢測；11-14號特征峰在紫外220nm下檢測；從左到右分別是特征峰1-14

圖4為不同提取溶劑得到的款冬花指紋圖譜對比

圖5為不同產(chǎn)地款冬花藥材指紋圖譜對比

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說明。各實施例中使用到的試劑和器材如下：

1儀器

agilent1260高效液相色譜儀(agilent公司)，g1311c四元梯度泵，g1329b自動進(jìn)樣器，g1316a柱溫箱，g1314f紫外檢測器，超聲波清洗器(kq5200e，昆山市超聲儀器有限公司)，色譜柱venusilmpc18(250mm×4.6mm，5μm)。

2試劑

乙腈(色譜純，fisher公司)，甲醇(色譜純，fisher公司)，超純水，乙酸(色譜純，fisher公司)，甲酸(色譜純，fisher公司)，其余試劑均為分析純。

表1不同產(chǎn)地款冬花藥材信息及相似度計算結(jié)果

實施例1色譜條件的確定及特征峰的指認(rèn)

1、流動相的選擇

實驗中共選擇五種流動相系統(tǒng)：即甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.03％乙酸水、乙腈-0.03％甲酸水、0.03％甲酸乙腈-0.03％甲酸水對款冬花進(jìn)行高效液相色譜的測定。如附圖1所示，甲醇-水系統(tǒng)與乙腈-水系統(tǒng)均可看到7個較高的色譜峰，但甲醇-水系統(tǒng)下各色譜峰出峰時間較晚，乙腈-水系統(tǒng)下特征色譜峰數(shù)目較少；乙腈-0.03％乙酸水系統(tǒng)與乙腈-0.03％甲酸水系統(tǒng)中基線漂移較嚴(yán)重，且乙腈-0.03％乙酸水系統(tǒng)中各峰分離度低，拖尾明顯。綜上所述，各流動相系統(tǒng)中以0.03％甲酸乙腈-0.03％甲酸水流動相系統(tǒng)為最佳，譜圖中各峰分離度較好，峰寬較窄且保留時間適中。

2、檢測波長的選擇

實驗中共選擇五個檢測波長，即210nm，230nm，254nm，326nm/220nm，254nm/220nm，在這五種檢測波長下色譜圖均有多個色譜峰，但綜合考慮各色譜峰分離程度與吸收度，發(fā)現(xiàn)在254nm/220nm各色譜峰明顯分離且吸收最強，因此選擇254nm/220nm作為檢測波長的最優(yōu)條件(見附圖2)，并選擇其圖譜中的14個色譜峰作為款冬花指紋圖譜的特征峰，以12號峰為參照峰，其相對保留時間如下：

1號峰：0.22±0.07；2號峰：0.26±0.03；3號峰：0.27±0.10；4號峰：0.41±0.01；5號峰：0.44±0.02；6號峰：0.48±0.16；7號峰：0.50±0.08；8號峰：0.53±0.10；9號峰：0.73±0.03；10號峰：0.74±0.17；11號峰：0.78±0.01；13號峰：1.23±0.13；14號峰：1.40±0.09(見附圖3)。

3、特征峰的指認(rèn)

經(jīng)對照品加樣比對，確定款冬花指紋圖譜中所選的14個特征峰中包括以下化合物：

1號峰：新綠原酸；2號峰：綠原酸；3號峰：隱綠原酸；4號峰：蘆丁；5號峰：金絲桃苷；6號峰：異綠原酸b；7號峰：異綠原酸a；8號峰：異綠原酸c；9號峰：槲皮素；10號峰：山奈酚；11號峰：色原酮；12號峰：款冬酮；13號峰：1β,8-bisangeloyloxy-3β,4β-epoxybisabola-7(14),10-diene；14號峰：款冬素酯。

4、供試品溶液制備方法的選擇

(1)取款冬花粉末1.0g，加入75％甲醇20ml，超聲提取1h，以75％甲醇補足損失重量，溶液過0.22μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即得待測液。

(2)取款冬花粉末1.0g，加入50％甲醇20ml，超聲提取1h，以50％甲醇補足損失重量，溶液過0.22μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即得待測液。

(3)取款冬花粉末1.0g，加入甲醇20ml，超聲提取1h，以甲醇補足損失重量，溶液過0.22μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即得待測液。

(4)取款冬花粉末1.0g，加入乙醇20ml，超聲提取1h，以乙醇補足損失重量，溶液過0.22μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即得待測液。

結(jié)果表明，加入75％甲醇超聲1小時，得到的指紋圖譜最好，色譜峰含量豐富且保留時間適中。色譜圖見附圖4。

實施例2指紋圖譜方法學(xué)考察

下述實驗的供試品溶液均采用如下方法制備：

取款冬花粉末1.0g，加入75％甲醇20ml，超聲提取1h，以75％甲醇補足損失重量，溶液過0.22μm微孔濾膜即得測試溶液。

精密度實驗：

取款冬花藥材(sx-9)，連續(xù)進(jìn)樣6次，把12號峰作為參照峰，記錄其余特征峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果顯示，各色譜峰的相對保留時間的rsd在0.02％～0.66％；相對峰面積的rsd在0.60％～2.05％，表明款冬花的待測溶液通過高效液相色譜分析，整個檢測系統(tǒng)的精密度良好。

重復(fù)性實驗：

取款冬花藥材(sx-9)，備樣6份，進(jìn)行高效液相色譜的測定，把12號峰作為參照峰，記錄其余特征峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果顯示，各色譜峰的相對保留時間的rsd在0.01％～0.09％；相對峰面積的rsd在0.28％～1.92％，表明該方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性實驗：

取款冬花藥材(sx-9)，分別在0小時、2小時、4小時、6小時、8小時、12小時和24小時進(jìn)樣測定，把12號峰作為參照峰，記錄其余特征峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果表明，樣品24h各色譜峰的相對保留時間的rsd在0.01％～0.64％；相對峰面積的rsd在0.63％～2.18％，表明款冬花的待測溶液在24h內(nèi)通過高效液相色譜分析穩(wěn)定性良好。

實施例3不同產(chǎn)地款冬花液相指紋圖譜比較

利用上述建立的款冬花液相指紋圖譜條件對26批不同產(chǎn)地款冬花藥材(表1)進(jìn)行測定。

取款冬花粉末1.0g，加入75％甲醇20ml，超聲提取1h，以75％甲醇補足損失重量，溶液過0.22μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即得待測液。以色譜柱venusilmp(250mm×4.6mm，5μm)為固定相，按照如下液相條件進(jìn)行測試：

紫外檢測波長為254nm/220nm切換檢測；柱溫為25℃；進(jìn)樣量為10μl；流速為1ml/min；梯度洗脫條件為0-2min，5％a相；2-7min，5％-15％a相；7-35min，15％-30％a相；35-38min，30％-55％a相；38-45min，55％-75％a相；45-65min，75％-80％a相；65-80min，80％-95％a相(其中a相為0.03％甲酸乙腈，b相為0.03％甲酸水溶液)。每1次測樣完成后，系統(tǒng)平衡5min后再次進(jìn)樣。

如附圖5所示，不同產(chǎn)地款冬花液相指紋圖譜整體較為接近，但個別產(chǎn)地的樣本與其他樣本存在一定差異：河北產(chǎn)區(qū)款冬花的指紋圖譜輪廓接近，但2號圖譜各色譜峰信號較低；甘肅產(chǎn)區(qū)與內(nèi)蒙產(chǎn)區(qū)的款冬花藥材液相指紋圖譜相似，說明這兩個產(chǎn)地款冬花中各成分含量差異較??；山西產(chǎn)區(qū)的21號野生樣本與同一產(chǎn)地其他樣本的圖譜差異較大，主要表現(xiàn)為10min-30min內(nèi)各色譜峰信號響應(yīng)較低。因此對不同產(chǎn)地栽培款冬花指紋圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2008版》進(jìn)行評價，26批款冬花藥材與生成的對照圖譜相似度在0.9以上(見表1)。