本發(fā)明屬于免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)、人免疫缺陷病毒(hiv)和梅毒螺旋體(tp)等四種病原體的檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用和制備方法等。

背景技術(shù)：

乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)、人免疫缺陷病毒(hiv)和梅毒螺旋體(tp)均為國(guó)家規(guī)定的重大傳染性疾病，流行的范圍廣，嚴(yán)重影響人民的身體健康。其中，尤其是hiv，國(guó)際醫(yī)學(xué)界至今尚無(wú)防治艾滋病的有效疫苗、藥物和療法，自1985年在中國(guó)境內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)艾滋病病例報(bào)告數(shù)以來(lái)，我國(guó)艾滋病病例報(bào)告數(shù)平均以每年30％-40％的速度增加。

除了傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)檢查外，早期對(duì)這四種病原體的免疫學(xué)聯(lián)合檢測(cè)方法操作較為繁瑣，過(guò)程不容易標(biāo)準(zhǔn)化，檢測(cè)靈敏度低，尤其是特別容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。所以近年來(lái)，對(duì)這四種病原體的檢測(cè)逐漸傾向于用基于核酸的pcr法來(lái)檢測(cè)，例如，中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)cn101487062a公開(kāi)了一種同步檢測(cè)肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋體核酸的試劑盒，其采用一步法單管單酶多項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)的taqmanpcr擴(kuò)增體系；又如，中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)cn102230032a公開(kāi)了一種病原體核酸的等溫鏈置換多重檢測(cè)卡，可以多重檢測(cè)hbvdna、hcvrna、hivrna和tpdna，其采用等溫鏈置換來(lái)進(jìn)行多重檢測(cè)。

然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，由于pcr的靈敏度太高，而檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室難免不受各種檢測(cè)樣品的污染，即使進(jìn)行消毒，也很難完全去除各病原體的病毒核酸片段，因此造成不少假陽(yáng)性結(jié)果，容易引起糾紛。

近年來(lái)，對(duì)這四種病原體的免疫學(xué)聯(lián)合檢測(cè)方法也有所發(fā)展，但是主要使得過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)化，然而檢測(cè)靈敏度，尤其是結(jié)果準(zhǔn)確性方面，改進(jìn)不大。例如，中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)cn102023216a公開(kāi)了一種對(duì)乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病原體進(jìn)行共檢的懸浮芯片，可快捷地同時(shí)檢測(cè)待檢樣品中的乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病原體，然而本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，其檢測(cè)準(zhǔn)確性還有待進(jìn)一步提高，尤其是其容易造成hiv檢測(cè)假陰性結(jié)果，而這樣的結(jié)果是比假陽(yáng)性結(jié)果危害大得多的，因此至今未推廣使用。而中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)cn101373187a公開(kāi)了一種通過(guò)單次實(shí)驗(yàn)即可實(shí)現(xiàn)艾滋、乙肝、丙肝、梅毒這四種重大傳染病中的三到四項(xiàng)同時(shí)篩查的免疫層析試劑盒，其基于膠體金，所以這種試劑盒檢測(cè)靈敏度不高，而且混合劃線時(shí)也無(wú)法避免hiv檢測(cè)的假陰性結(jié)果。

為此，本發(fā)明人憑借長(zhǎng)期在本領(lǐng)域深耕的經(jīng)驗(yàn)，在經(jīng)歷大量實(shí)驗(yàn)失敗的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)要開(kāi)發(fā)乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒和梅毒螺旋體同時(shí)適用的高靈敏度、高精確度、高可靠性并且檢測(cè)方便迅速的免疫分析方法，需用多方面的協(xié)同改進(jìn)，包括抗原或抗體的設(shè)計(jì)或選擇，抗原或抗體載體的選擇，顯示(發(fā)光)標(biāo)記物的制備，以及陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照等。本發(fā)明人最終開(kāi)發(fā)出了同步檢測(cè)乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒和梅毒螺旋體的檢測(cè)試劑盒，其不但靈敏度高、可靠性好，不易受人為操作因素影響，尤其是能夠避免hiv的假陰性檢測(cè)結(jié)果的出現(xiàn)，而且操作方便迅速，操作便于標(biāo)準(zhǔn)化，可用于急診檢測(cè)等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種hbv、hcv、hiv和tp同時(shí)適用的高靈敏度、高精確度、高可靠性并且檢測(cè)方便迅速的同步檢測(cè)試劑盒及其免疫分析hbv抗原、hcv抗體、hiv抗原和抗體以及tp抗體中的應(yīng)用和其中試劑的制備方法等。

具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了同時(shí)檢測(cè)樣品中hbv抗原、hcv抗體、hiv抗原和抗體以及tp抗體的免疫檢測(cè)試劑盒，其包括：

(1.1)第1.1容器，其中容納用hbsag抗體標(biāo)記的磁微粒；

(1.2)第1.2容器，其中容納用hcv抗原標(biāo)記的磁微粒；

(1.3)第1.3容器，其中容納用hiv抗原標(biāo)記的磁微粒；

(1.4)第1.4容器，其中容納用hivp24抗體標(biāo)記的磁微粒；

(1.5)第1.5容器，其中容納用tp抗原標(biāo)記的磁微粒；

(2.1)第2.1容器，其中容納與hbsag抗體偶聯(lián)的吖啶酯；

(2.2)第2.2容器，其中容納與hcv抗原偶聯(lián)的吖啶酯；

(2.3)第2.3容器，其中容納與hiv抗原偶聯(lián)的吖啶酯；

(2.4)第2.4容器，其中容納與hivp24抗體偶聯(lián)的吖啶酯；

(2.5)第2.5容器，其中容納與tp抗原偶聯(lián)的吖啶酯；

(3)第三容器，其中容納hbsag陽(yáng)性對(duì)照；

(4)第四容器，其中容納hcv陽(yáng)性對(duì)照；

(5)第五容器，其中容納hiv陽(yáng)性對(duì)照；

(6)第六容器，其中容納tp陽(yáng)性對(duì)照；和，

(7)第七容器，其中容納陰性對(duì)照。

在本文中，樣品是潛在可能含有hbv抗原、hcv抗體、hiv抗原和/或抗體和/或tp抗體的離體樣品，如血液、血液制品、體液等。本發(fā)明的檢測(cè)方法所針對(duì)的目標(biāo)——病原體抗原和/或抗體，其中，病原體抗原是病原體的蛋白質(zhì)或片段，病原體抗體是人體免疫系統(tǒng)應(yīng)對(duì)相應(yīng)病原體自然產(chǎn)生的(多克隆)抗體。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，可以同時(shí)檢測(cè)hbv抗原、hcv抗體、hiv抗原和抗體以及tp抗體。這些抗原和抗體能夠在一定程度上表征hbv、hcv、hiv和tp的存在性。

需要指出的是，本發(fā)明的檢測(cè)用于對(duì)離體樣品的檢測(cè)，檢測(cè)的直接結(jié)果是抗體的存在性與否，而并非診斷結(jié)果。即使對(duì)于利用本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)人血液樣品中病原體抗原和抗體，也只能直接得出抗原和抗體的存在與否，還需要有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生根據(jù)相應(yīng)人的體質(zhì)、病史、臨床癥狀等綜合情況才能判斷出檢測(cè)出的相應(yīng)抗原的量是否能致病、相應(yīng)抗體已經(jīng)遏制了病毒或不足以抵抗病毒的診斷結(jié)果或健康狀況。因此無(wú)法根據(jù)抗原、抗體的存在而直接判斷其攜帶者是否患有由這四種病原體帶來(lái)的疾病，所以本發(fā)明直接目的不是診斷。所以，本發(fā)明的試劑盒的應(yīng)用不屬于診斷方法。

在本文中，如無(wú)特別說(shuō)明，“第1.1”、“第2.3”、“第三”、“第五”等序數(shù)詞僅僅是對(duì)具有相同或相似用途的物品或物質(zhì)的區(qū)分，并不對(duì)物品或物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、組成、性質(zhì)和形狀等構(gòu)成限定。例如，第四容器和第五容器可以是材料、形狀完全相同的容器，但是是不同的容器，分別容納hcv陽(yáng)性對(duì)照和hiv陽(yáng)性對(duì)照。容器可以是瓶、管或杯，使得其中的容納物被分隔保存。

優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的試劑盒中，用各抗體或抗原標(biāo)記的磁微粒可以混合容納于同一容器中，這樣不影響也便于四種病原體的同步檢測(cè)，即第1.1容器、第1.2容器、第1.3容器、第1.4容器和第1.5容器是同一容器，如，第一容器。當(dāng)然，為了便于對(duì)同步檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行病原體區(qū)分，第1.1容器、第1.2容器、第1.3容器、第1.4容器和第1.5容器可以是不同的容器。

也優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的試劑盒中，與各抗體或抗原偶聯(lián)的吖啶酯可以混合容納于同一容器中，這樣不影響也便于四種病原體的同步檢測(cè)，即第2.1容器、第2.2容器、第2.3容器、第2.4容器和第2.5容器是同一容器，如，第二容器。當(dāng)然，為了便于對(duì)同步檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行病原體區(qū)分，第2.1容器、第2.2容器、第2.3容器、第2.4容器和第2.5容器可以是不同的容器。

優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的試劑盒中，hiv抗原的氨基酸序列如seqidno：1所示。本發(fā)明人設(shè)計(jì)的該抗原能方便地連接于發(fā)光標(biāo)記物和磁微粒上，仍舊保持效價(jià)高、特異性好的優(yōu)勢(shì)，并且涵蓋了hiv-i型和ii型的測(cè)定。該抗原能夠通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的重組方法生產(chǎn)，當(dāng)前已經(jīng)有商業(yè)渠道提供重組生產(chǎn)蛋白(抗原)的服務(wù)。

優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的試劑盒中，磁微粒是粒徑0.90-1.10μm的含有羧基基團(tuán)的磁微粒。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)這樣的磁微粒對(duì)本發(fā)明的抗原的標(biāo)記率高，施加磁力后聚集迅速，并且吸附一致性好。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，磁微粒是em1-40/100型號(hào)的磁微粒。更優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的試劑盒中，用各病原體的抗原或抗體標(biāo)記的磁微粒的制備方法包括：將edc和nhs混合溶于mes中，加入磁微粒，震蕩，棄上清液，清洗后加入各病原體的抗原或抗體進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)，然后加入賴氨酸封閉，再洗滌。

優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的試劑盒中，吖啶酯是吖啶琥珀酰亞胺酯。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)該吖啶酯基本不影響本發(fā)明的抗原效價(jià)，而且發(fā)光好。更優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的試劑盒中，與各病原體的抗原或抗體偶聯(lián)吖啶酯的制備方法包括：將吖啶琥珀酰亞胺酯的dmf溶液與各病原體的抗原或抗體的pb溶液混合，攪拌后加入賴氨酸封閉，再透析。

優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的試劑盒中，陰性對(duì)照是hbsag、hcv、hiv和tp檢測(cè)確認(rèn)均呈陰性的人血清；hbsag陽(yáng)性對(duì)照是hbsag檢測(cè)確認(rèn)呈陽(yáng)性的人血清，優(yōu)選是hbsag檢測(cè)確認(rèn)呈陽(yáng)性但hcv、hiv和tp檢測(cè)確認(rèn)均呈陰性的人血清；hcv陽(yáng)性對(duì)照是hcv檢測(cè)確認(rèn)呈陽(yáng)性的人血清，優(yōu)選是hcv檢測(cè)確認(rèn)呈陽(yáng)性但hbsag、hiv和tp檢測(cè)確認(rèn)呈陰性的人血清；hiv陽(yáng)性對(duì)照是hiv檢測(cè)確認(rèn)呈陽(yáng)性的人血清，優(yōu)選是hiv檢測(cè)確認(rèn)呈陽(yáng)性但hbsag、hcv和tp檢測(cè)確認(rèn)呈陰性的人血清；以及，tp陽(yáng)性對(duì)照是tp檢測(cè)確認(rèn)呈陽(yáng)性的人血清，優(yōu)選是tp檢測(cè)確認(rèn)呈陽(yáng)性但hbsag、hcv和hiv檢測(cè)確認(rèn)呈陰性的人血清。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，由于操作人員水平的參差不齊，所以會(huì)出現(xiàn)帶有傾向性的檢測(cè)結(jié)果，通過(guò)設(shè)置這些對(duì)照，并且配合閾值判讀，可以有效避免檢測(cè)結(jié)果受人為操作因素的影響。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，人血清是在60℃保溫1小時(shí)后過(guò)濾除菌而制備得到的。各人血清可在知情同意下由相應(yīng)人員捐贈(zèng)，也可購(gòu)自疾控中心。

在本文中，“任選”具有辭典意義，即涵蓋選或不選兩種情況的范圍。本發(fā)明第一方面的試劑盒任選還包括分別容納洗液、第一激發(fā)液、第二激發(fā)液、磁微粒稀釋液和/或吖啶酯偶聯(lián)物稀釋液的容器，即可以包括這些容器，也可以不包括這些容器。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，本發(fā)明第一方面的試劑盒還包括分別容納洗液、第一激發(fā)液、第二激發(fā)液、磁微粒稀釋液和/或吖啶酯偶聯(lián)物稀釋液的容器。

更優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的試劑盒中，洗液包含吐溫20；第一激發(fā)液包含硝酸和h2o2；第二激發(fā)液包含naoh；磁微粒稀釋液包含牛血清白蛋白和吐溫20；和/或，吖啶酯偶聯(lián)物稀釋液包含牛血清白蛋白和吐溫20。其中，磁微粒稀釋液和吖啶酯偶聯(lián)物稀釋液的配方可以是相同的。

另外，本發(fā)明第一方面的試劑盒還可以包括記載其應(yīng)用(如本發(fā)明第二方面的應(yīng)用)的說(shuō)明書(shū)。又如，本發(fā)明第一方面的試劑盒可以同磁板、微孔板和/或閃光發(fā)光儀等儀器搭配出售，因此本發(fā)明還提供包括本發(fā)明第一方面的試劑盒以及任選儀器的產(chǎn)品。

在第二方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的試劑盒在同時(shí)檢測(cè)樣品中hbv抗原、hcv抗體、hiv抗原和抗體以及tp抗體的方法中的應(yīng)用；相應(yīng)地，本發(fā)明也提供了本發(fā)明第一方面的試劑盒在制備用于同時(shí)檢測(cè)樣品中hbv抗原、hcv抗體、hiv抗原和抗體以及tp抗體的方法的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

優(yōu)選在本發(fā)明第二方面的應(yīng)用中，同時(shí)檢測(cè)樣品中hbv抗原、hcv抗體、hiv抗原和抗體以及tp抗體的方法依次包括：

(1)將第1.1容器、第1.2容器、第1.3容器、第1.4容器和第1.5容器中的磁微?；旌虾?如果第1.1容器、第1.2容器、第1.3容器、第1.4容器和第1.5容器是同一容器，則直接取樣)，上樣于微孔板的各孔中并洗滌；

(2)向各孔中分別加入樣品、陰性對(duì)照、hbsag陽(yáng)性對(duì)照、hcv陽(yáng)性對(duì)照、hiv陽(yáng)性對(duì)照和tp陽(yáng)性對(duì)照并溫育；

(3)將第2.1容器、第2.2容器、第2.3容器、第2.4容器和第2.5容器中吖啶酯混合后(如果第2.1容器、第2.2容器、第2.3容器、第2.4容器和第2.5容器是同一容器，則直接取樣)，加入各孔中并溫育；

(4)微孔板施加磁力以吸住磁微粒，棄去孔中液體并洗滌；

(5)向各孔中同時(shí)滴加第一激發(fā)液和第二激發(fā)液，用閃光發(fā)光儀檢測(cè)各孔的相對(duì)發(fā)光單位；和，

(6)以所測(cè)得的陰性對(duì)照的相對(duì)發(fā)光單位乘以2.1倍，作為閾值，樣品檢測(cè)值高于或等于閾值者為陽(yáng)性，低于閾值者為陰性，任一陽(yáng)性對(duì)照的檢測(cè)值低于閾值，則從步驟(1)開(kāi)始重新檢測(cè)。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，以相對(duì)發(fā)光單位乘以2.1倍作為閾值，并且對(duì)陽(yáng)性對(duì)照的檢測(cè)進(jìn)行嚴(yán)格要求，可以有效避免不同操作人員引入的操作誤差。

在第三方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的試劑盒的制備方法，其包括用hbsag抗體標(biāo)記磁微粒的制備，用hcv抗原標(biāo)記磁微粒的制備，用hiv抗原標(biāo)記磁微粒的制備，用hivp24抗體標(biāo)記磁微粒的制備，用tp抗原標(biāo)記磁微粒的制備，與hbsag抗體偶聯(lián)吖啶酯的制備，與hcv抗原偶聯(lián)吖啶酯的制備，與hiv抗原偶聯(lián)吖啶酯的制備，與hivp24抗體偶聯(lián)吖啶酯的制備，與tp抗原偶聯(lián)吖啶酯的制備，和陰性對(duì)照、hbsag陽(yáng)性對(duì)照、hcv陽(yáng)性對(duì)照、hiv陽(yáng)性對(duì)照和tp陽(yáng)性對(duì)照的制備，任選還包括洗液、第一激發(fā)液、第二激發(fā)液、磁微粒稀釋液和/或吖啶酯偶聯(lián)物稀釋液的配制。

本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明的試劑盒不但靈敏度高、精確度高、可靠性好，不易受人為操作因素影響，尤其是能夠有效避免hiv檢測(cè)的假陰性結(jié)果，而且操作方便迅速，操作便于標(biāo)準(zhǔn)化，可用于急診檢測(cè)等。

為了便于理解，以下將通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說(shuō)明書(shū)的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是顯而易見(jiàn)的。

另外，本發(fā)明引用了公開(kāi)文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過(guò)一樣。

具體實(shí)施方式

以下本文將通過(guò)具體的實(shí)施例來(lái)描述發(fā)明。如未特別指明之處，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(coldspringharborlaboratorypress)、《細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，北京，中國(guó)，2001年)、《rna實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)》(科學(xué)出版社,北京,中國(guó),2004年)、《免疫檢測(cè)技術(shù)》(科學(xué)出版社,北京,中國(guó),1991)等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)以及本文所引用的參考文獻(xiàn)中所列方法來(lái)實(shí)施；其中的試劑均可通過(guò)商業(yè)渠道獲得，經(jīng)測(cè)試，磁微粒選用可購(gòu)自默克(merck)公司的em1-40/100型號(hào)的磁微粒，吖啶酯選用可購(gòu)自sigma-aldrich的吖啶琥珀酰亞胺酯。

實(shí)施例1乙型肝炎病毒(hbv)檢測(cè)試劑的確定

經(jīng)本發(fā)明人研究，如果要同時(shí)檢測(cè)四種病原體，其中的hbv檢測(cè)不適合使用hbv抗原，否則很容易造成假陽(yáng)性結(jié)果，故而使用抗hbv抗原的抗體。經(jīng)測(cè)試，使用多克隆抗體將導(dǎo)致同時(shí)檢測(cè)結(jié)果很不穩(wěn)定，最終選擇了針對(duì)hbsag不同位點(diǎn)的單抗組合hbsab-1和hbsab-2(可購(gòu)自菲鵬生物股份有限公司,貨號(hào)hbsab-1、hbsab-2)，盡管不是所測(cè)試中效價(jià)最高的單抗，但是在同時(shí)檢測(cè)中準(zhǔn)確性最好，故使用不同位點(diǎn)的hbsag單抗制備標(biāo)記的磁微粒和吖啶酯偶聯(lián)物。

1.1標(biāo)記的磁微粒的制備

將碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)分別用0.05mph5.0的2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(mes)分別溶解定容至20mg/ml，各取200μl的edc和nhs溶液混合，加入1mg磁微粒，于室溫(25℃)震蕩混勻40分鐘，然后棄上清液，用0.1mpbs(ph7.4)清洗三次，最后一次清洗液不棄置，然后加入hbsag-1單抗25μg，在25℃進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記時(shí)間1小時(shí)，標(biāo)記后加入賴氨酸，使之濃度達(dá)到25mm，反應(yīng)30分鐘，以封閉多余的位點(diǎn)，再用0.1mpbs(ph7.4)洗滌三次，獲得的標(biāo)記的磁微粒置于含1％(w/v，g/ml)牛血清白蛋白的0.01mpbs(ph7.4)中，于2-8℃保存。

1.2吖啶酯偶聯(lián)物的制備

將吖啶琥珀酰亞胺酯用無(wú)水二甲基亞酰胺(dmf)溶解定容至0.2mg/ml,取100μghbsag-2單抗26μl(蛋白濃度2.8mg/ml)，用0.1mpb(ph8.0)透析，加入0.2mg/ml的吖啶琥珀酰亞胺酯25μl，在室溫(25℃)下攪拌20分鐘，加入含1％賴氨酸的0.1mpb(ph8.0)，使賴氨酸的終濃度達(dá)到0.25％，室溫(25℃)封閉30分鐘，用0.01mpbs(ph6.3)進(jìn)行透析，透析后加入甘油-20℃存放。

1.3陽(yáng)性對(duì)照的制備

取hbsag檢測(cè)確認(rèn)呈陽(yáng)性且hcv、hiv和tp檢測(cè)確認(rèn)均呈陰性的人血清，在60℃保溫1小時(shí)后，過(guò)濾除菌即得，于2～8℃保存。

1.4陰性對(duì)照的制備

取hbsag、hcv、hiv和tp檢測(cè)確認(rèn)均呈陰性的人血清，在60℃保溫1小時(shí)后，過(guò)濾除菌，即得，于2～8℃保存。實(shí)施例2-5的陰性對(duì)照均與該陰性對(duì)照相同，下文略。

實(shí)施例2丙型肝炎病毒(hcv)檢測(cè)試劑的確定

經(jīng)本發(fā)明人研究，如果要同時(shí)檢測(cè)四種病原體，其中的hcv檢測(cè)不適合使用hcv抗體，否則很容易造成假陽(yáng)性結(jié)果，故而使用hcv抗原h(huán)cv12和hcv13(可購(gòu)自廈門(mén)同仁心醫(yī)藥有限公司,貨號(hào)分別是hcv12、hcv13)，包含hcv的core、ns3、ns4、ns5抗原片段。經(jīng)測(cè)試，這些hcv抗原與hiv、tp抗原無(wú)交叉反應(yīng)，使用它制備標(biāo)記的磁微粒和吖啶酯偶聯(lián)物。

2.1標(biāo)記的磁微粒的制備

將碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)分別用0.05mph5.0的2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(mes)分別溶解定容至20mg/ml，各取100μl的edc和nhs溶液混合，加入1mg磁微粒，于室溫(25℃)震蕩混勻40分鐘，然后棄上清液，用0.1mpbs(ph7.4)清洗三次，最后一次清洗液不棄置，然后加入上述hcv12抗原10μg，在25℃進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記時(shí)間1小時(shí)，標(biāo)記后加入賴氨酸，使之濃度達(dá)到25mm，反應(yīng)30分鐘，以封閉多余的位點(diǎn)，再用0.1mpbs(ph7.4)洗滌三次，獲得的標(biāo)記磁微粒置于含1％(w/v)牛血清白蛋白的0.01mpbs(ph7.4)中，于2-8℃保存。

2.2吖啶酯偶聯(lián)物的制備

將吖啶琥珀酰亞胺酯用無(wú)水二甲基亞酰胺(dmf)溶解定容至0.2mg/ml,取100μg上述hcv13抗原100μl(蛋白濃度1mg/ml)，用0.1mpb(ph8.0)透析，與吖啶琥珀酰亞胺酯溶液20μl混合，在室溫(25℃)下攪拌20分鐘，然后加入含1％(w/v)賴氨酸的0.1mpb(ph8.0)，使賴氨酸的終濃度達(dá)到0.25％(w/v)，于室溫(25℃)封閉30分鐘，然后用0.01mpbs(ph6.3)進(jìn)行透析，透析后加入甘油于-20℃保存。

2.3陽(yáng)性對(duì)照的制備

取hcv檢測(cè)確認(rèn)呈陽(yáng)性且hbsag、hiv和tp檢測(cè)確認(rèn)均呈陰性的人血清，在60℃保溫1小時(shí)后，過(guò)濾除菌即得，于2～8℃保存。

實(shí)施例3人免疫缺陷病毒(hiv)檢測(cè)試劑1的確定

經(jīng)本發(fā)明人研究，如果要同時(shí)檢測(cè)四種病原體，其中的hiv檢測(cè)相當(dāng)復(fù)雜，故而在其檢測(cè)試劑1中使用hiv抗原。經(jīng)研究，委托合成了氨基酸序列如seqidno：1所示的hiv重組抗原，其可涵蓋hiv-1和hiv-ii型病毒的檢測(cè)，并與hcv、tp抗原無(wú)交叉反應(yīng)，使用它制備標(biāo)記的磁微粒和吖啶酯偶聯(lián)物。

3.1標(biāo)記的磁微粒的制備

將碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)分別用0.05mph5.0的2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(mes)分別溶解定容至20mg/ml，各取100μl的edc和nhs溶液混合，加入1mg磁微粒，于室溫(25℃)震蕩混勻40分鐘，然后棄上清液，用0.1mpbs(ph7.4)清洗三次，最后一次清洗液不棄置，然后加入上述抗原10μg，在25℃進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記時(shí)間1小時(shí)，標(biāo)記后加入賴氨酸，使之濃度達(dá)到25mm，反應(yīng)30分鐘，以封閉多余的位點(diǎn)，再用0.1mpbs(ph7.4)洗滌三次，獲得的標(biāo)記磁微粒置于含1％(w/v)牛血清白蛋白的0.01mpbs(ph7.4)中，于2-8℃保存。

3.2吖啶酯偶聯(lián)物的制備

將吖啶琥珀酰亞胺酯用無(wú)水二甲基亞酰胺(dmf)溶解定容至0.2mg/ml,取100μg上述抗原71μl(蛋白濃度1.4mg/ml),用0.1mpb(ph8.0)透析，與吖啶琥珀酰亞胺酯溶液20μl混合，在室溫(25℃)下攪拌20分鐘，然后加入含1％(w/v)賴氨酸的0.1mpb(ph8.0)，使賴氨酸的終濃度達(dá)到0.25％(w/v)，于室溫(25℃)封閉30分鐘，然后用0.01mpbs(ph6.3)進(jìn)行透析，透析后加入甘油于-20℃保存。

3.3陽(yáng)性對(duì)照的制備

取hiv檢測(cè)確認(rèn)呈陽(yáng)性且hcv、hbsag和tp檢測(cè)確認(rèn)均呈陰性的人血清，在60℃保溫1小時(shí)后，過(guò)濾除菌即得，于2～8℃保存。實(shí)施例4的陽(yáng)性對(duì)照與該陽(yáng)性對(duì)照相同，下文略。

實(shí)施例4人免疫缺陷病毒(hiv)p24抗體檢測(cè)試劑2的確定

經(jīng)本發(fā)明人研究，hiv四代不僅檢測(cè)hivi型和ii型抗體，同時(shí)檢測(cè)hivp24抗原，其中的hiv檢測(cè)相當(dāng)復(fù)雜，同時(shí)檢測(cè)中假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的消除很難用一種試劑完成，經(jīng)測(cè)試，hivp24抗體采用單克隆抗體p24-ab(可購(gòu)自菲鵬生物股份有限公司,貨號(hào)p24-ab)，其與hiv抗原、hcv抗原、tp抗原以及hbsag單抗均無(wú)交叉反應(yīng)，對(duì)hiv檢測(cè)試劑1的缺點(diǎn)進(jìn)行了有效彌補(bǔ)，故使用它制備標(biāo)記的磁微粒和吖啶酯偶聯(lián)物。

4.1標(biāo)記磁微粒的制備

將碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)分別用0.05mph5.0的2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(mes)分別溶解定容至20mg/ml，各取200μl的edc和nhs溶液混合，加入1mg磁微粒，于室溫(25℃)震蕩混勻40分鐘，然后棄上清液，用0.1mpbs(ph7.4)清洗三次，最后一次清洗液不棄置，然后加入p24-ab單抗25μg，在25℃進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記時(shí)間1小時(shí)，標(biāo)記后加入賴氨酸，使之濃度達(dá)到25mm，反應(yīng)30分鐘，以封閉多余的位點(diǎn)，再用0.1mpbs(ph7.4)洗滌三次，獲得的標(biāo)記的磁微粒置于含1％(w/v)牛血清白蛋白的0.01mpbs(ph7.4)中，于2-8℃保存。

4.2吖啶酯偶聯(lián)物的制備

將吖啶琥珀酰亞胺酯用無(wú)水二甲基亞酰胺(dmf)溶解定容至0.2mg/ml,取100μgp24單抗62.5μl(蛋白濃度1.6mg/ml)，用0.1mpb(ph8.0)透析，加入0.2mg/ml的吖啶琥珀酰亞胺酯25μl，在室溫(25℃)下攪拌20分鐘，加入含1％賴氨酸的0.1mpb(ph8.0)，使賴氨酸的終濃度達(dá)到0.25％，室溫(25℃)封閉30分鐘，用0.01mpbs(ph6.3)進(jìn)行透析，透析后加入甘油-20℃存放。

實(shí)施例5梅毒螺旋體(tp)檢測(cè)試劑的確定

經(jīng)本發(fā)明人研究，如果要同時(shí)檢測(cè)四種病原體，其中的tp檢測(cè)不適合使用tp抗體，否則很容易造成假陽(yáng)性結(jié)果，故而使用tp抗原。經(jīng)測(cè)試，采用tp重組抗原(購(gòu)自杭州弘距生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)tp)，其包含tp的15kd、17k、47kd抗原片段，與hiv、hcv抗原無(wú)交叉反應(yīng)，故使用它制備標(biāo)記的磁微粒和吖啶酯偶聯(lián)物。

5.1標(biāo)記磁微粒的制備

將碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)分別用0.05mph5.0的2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(mes)分別溶解定容至20mg/ml，各取100μl的edc和nhs溶液混合，加入1mg磁微粒，于室溫(25℃)震蕩混勻40分鐘，然后棄上清液，用0.1mpbs(ph7.4)清洗三次，最后一次清洗液不棄置，然后加入上述抗原30μg，在25℃進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記時(shí)間1小時(shí)，標(biāo)記后加入賴氨酸，使之濃度達(dá)到25mm，反應(yīng)30分鐘，以封閉多余的位點(diǎn)，再用0.1mpbs(ph7.4)洗滌三次，獲得的標(biāo)記的磁微粒置于含1％(w/v)牛血清白蛋白的0.01mpbs(ph7.4)中，于2-8℃保存。

5.2吖啶酯偶聯(lián)物的制備

將吖啶琥珀酰亞胺酯用無(wú)水二甲基亞酰胺(dmf)溶解定容至0.2mg/ml,取100μgtp抗原66.7μl(蛋白濃度1.5mg/ml)，用0.1mpb(ph8.0)透析，加入0.2mg/ml的吖啶琥珀酰亞胺酯30μl，在室溫(25℃)下攪拌20分鐘，加入含1％賴氨酸的0.1mpb(ph8.0)，使賴氨酸的終濃度達(dá)到0.25％，室溫(25℃)封閉30分鐘，用0.01mpbs(ph6.3)進(jìn)行透析，透析后加入甘油-20℃存放。

5.3陽(yáng)性對(duì)照的制備

取tp檢測(cè)確認(rèn)呈陽(yáng)性且hcv、hiv和hbsag檢測(cè)確認(rèn)均呈陰性的人血清，在60℃保溫1小時(shí)后，過(guò)濾除菌即得，于2～8℃保存。

實(shí)施例6同步檢測(cè)試劑盒

本發(fā)明的同步檢測(cè)試劑盒可以包括15個(gè)容器，分別裝有實(shí)施例1-5各自制備的標(biāo)記的磁微粒、實(shí)施例1-5各自制備的吖啶酯偶聯(lián)物、陰性對(duì)照、實(shí)施例1-3、5各自制備的陽(yáng)性對(duì)照。該同步檢測(cè)試劑盒不但可以進(jìn)行四種病原體的同步檢測(cè)，而且可以在同步檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性后，使用其中的部分試劑檢測(cè)確認(rèn)具體的病原體。

當(dāng)然，如果僅為了同步檢測(cè)，實(shí)施例1-5各自制備的標(biāo)記的磁微?？梢曰旌涎b在一個(gè)容器中，實(shí)施例1-5各自制備的吖啶酯偶聯(lián)物也可以混合裝在一個(gè)容器中，這樣的同步檢測(cè)試劑盒可以僅包括7個(gè)容器。

另外，本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒還可以包括分別裝有以下試劑的容器：洗液(其配方為：0.01m磷酸鹽緩沖液ph7.4、0.05％(v/v)吐溫20)、激發(fā)液a(其配方為：含0.05m硝酸溶液、0.15％(v/v)h2o2)和激發(fā)液b(其配方為：0.2mnaoh溶液)，另外還可以包括磁微粒稀釋液(其配方為：0.02m磷酸緩沖液ph7.4，1％(w/v，g/ml)牛血清白蛋白，0.1％(v/v)吐溫20)和吖啶酯偶聯(lián)物稀釋液(其配方為：0.02m磷酸緩沖液ph7.4、1％(w/v，g/ml)牛血清白蛋白，0.1％(v/v)吐溫20)。

實(shí)施例7四種病原體的同步檢測(cè)

同步檢測(cè)的具體過(guò)程如下：

(1)將實(shí)施例1-5制備的5種標(biāo)記的磁微粒(用磁微粒稀釋液將磁微粒濃度稀釋至0.5μg/μl)混合后，加入微孔板的孔中，每孔各種標(biāo)記的磁微粒各10μl，底部施加磁力以吸住磁微粒，棄去孔中液體；

(2)進(jìn)行洗滌，每孔加300μl洗液，撤去磁力振蕩混勻后，靜置20秒，施加磁力，棄去孔中液體，如此共洗滌5次；

(3)向每孔中分別加入樣品、陰性對(duì)照、各種陽(yáng)性對(duì)照50μl，37℃溫育20分鐘；

(4)將實(shí)施例1-5制備的5種吖啶酯偶聯(lián)物(用吖啶酯偶聯(lián)物稀釋液將吖啶酯濃度稀釋至0.05μm)混合后，加入微孔板的孔中，每孔各種吖啶酯偶聯(lián)物各10μl，置37℃溫育20分鐘，然后底部施加磁力以吸住磁微粒，棄去孔中液體；

(5)進(jìn)行洗滌，其與步驟(2)相同，共洗滌5次；

(6)每孔同時(shí)滴加激發(fā)液a和激發(fā)液b各100μl，在滴加得同時(shí)用閃光發(fā)光儀(可購(gòu)自promage公司)進(jìn)行檢測(cè)各孔的相對(duì)發(fā)光單位(rlu)。

以所測(cè)得的陰性對(duì)照發(fā)光值的平均值乘以2.1倍，作為閾值，樣品發(fā)光值除以陰性對(duì)照發(fā)光平均值，高于或等于閾值者為陽(yáng)性，低于閾值者為陰性。

對(duì)于檢測(cè)陽(yáng)性的樣品，再單獨(dú)使用實(shí)施例1-5制備的標(biāo)記的磁微粒和吖啶酯偶聯(lián)物確認(rèn)具體的病原體，檢測(cè)步驟基本與上述步驟相同，所不同的是僅加10μl標(biāo)記的磁微粒并用磁微粒稀釋液補(bǔ)足至50μl，以及僅加10μl吖啶酯偶聯(lián)物并用吖啶酯偶聯(lián)物稀釋液補(bǔ)足至50μl。

使用上述方法對(duì)不同來(lái)源的曾經(jīng)被誤診的人血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照之任一檢測(cè)出現(xiàn)異常的微孔板重新檢測(cè)(該板結(jié)果棄用)，檢測(cè)結(jié)果如下表所示，同步檢測(cè)僅在hcv和hiv樣品中出現(xiàn)微量假陽(yáng)性結(jié)果，其中hiv樣品的假陽(yáng)性結(jié)果可以用本發(fā)明的試劑盒本身進(jìn)一步檢測(cè)排除，未出現(xiàn)假陰性結(jié)果，該檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性已經(jīng)超過(guò)現(xiàn)有的四種病原體的同步免疫檢測(cè)產(chǎn)品了；重復(fù)10孔檢測(cè)，變異系數(shù)(cv)介于4.24～12.71％，均≤15％，說(shuō)明該方法精密性好。

序列表

<110>蘇州華益美生物科技有限公司

<120>四病原體同步檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用和制備

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