本發(fā)明涉及害蟲化學防治領域，具體地說，涉及一種檢測二化螟抗藥性的方法。

背景技術：

二化螟chilosuppressalis(walker)，屬鱗翅目螟蛾科，是水稻的重要害蟲之一，可為害水稻形成枯鞘、枯心、死孕穗、白穗和蟲傷株等癥狀，對水稻生產造成重大損失。近年來，由于氣候、耕作制度和栽培方式的改變，二化螟種群呈迅猛上升勢頭，尤其在1998年以后，已成為長江流域及江南稻區(qū)的首要害蟲，嚴重阻礙了水稻的穩(wěn)產和高產。長期以來，化學藥劑防治是控制二化螟為害的主要措施，但是由于藥劑的長期不合理使用，導致二化螟對多種藥劑都產生了不同程度的抗性，大量藥劑對二化螟的防治效果明顯下降。為了及時有效地控制二化螟為害，必須對田間二化螟種群進行抗藥性監(jiān)測，明確抗藥性水平，制定科學的用藥方案指導生產。

害蟲抗藥性監(jiān)測是害蟲抗藥性治理的基礎工作，目的是為了明確害蟲的抗性水平、抗性分布情況、抗性變化的時空動態(tài)以及檢測抗性治理措施的效果等。害蟲是否產生抗藥性以及抗性程度的高低，主要是通過比較田間種群與相對敏感種群的ld50(或lc50)值來判斷。而抗藥性檢測結果是否準確，則與采用的抗藥性檢測方法和敏感毒力基線密切相關。因此，培育敏感品系，建立準確而又簡便、快速的抗藥性檢測方法和敏感毒力基線是開展害蟲抗藥性監(jiān)測的前提。目前，在二化螟的抗藥性監(jiān)測中，不同實驗室相繼采用點滴法、稻苗浸漬法和人工飼料藥膜法。點滴法是fao推薦的方法。早期的點滴法測定的蟲期是6齡幼蟲，但是由于6齡幼蟲飼養(yǎng)時間長，費時費力，個體間差異大，給選擇標準試蟲帶來較大難度，后來改為4齡幼蟲并建立了相應的敏感毒力基線，并以此制定了農業(yè)部行業(yè)標準ny/t2058-2011。但該法需要精密的點滴工具(例如微量點滴儀)，且僅適用于觸殺性藥劑，只能反應殺蟲劑的觸殺毒力，不能體現殺蟲劑的胃毒作用，不適于檢測胃毒作用為主的藥劑的毒力和抗性。稻苗浸漬法可以同時檢測胃毒和觸殺作用，充分反映殺蟲劑的毒力。但是，該法需要預先準備好生長3周左右的水稻苗，藥后5-6天檢查試驗結果，顯得費時耗工，比較繁瑣，而且在處理3-4天后稻苗即開始變黃枯萎，對試蟲的存活不利從而影響試驗結果的準確性。人工飼料藥膜法也可以同時檢測胃毒和觸殺作用，可以充分反映殺蟲劑的毒力。但該法的主要缺陷是藥劑在飼料表面分布不均勻，而且選用初孵幼蟲為試蟲，在調查試驗結果時因蟲體太小而難以準確判斷試蟲的存活情況。因此，有必要建立一套簡便、快速、準確且適用性廣的二化螟抗藥性檢測新方法。

診斷劑量是指引起99％敏感種群個體死亡的劑量。應用診斷劑量監(jiān)測害蟲田間種群抗藥性是聯合國糧農組織推薦的方法。該方法認為用診斷劑量處理田間種群后，只有抗性個體才能存活。傳統(tǒng)的點滴法、稻苗浸漬法和人工飼料藥膜法進行毒力測定，操作繁瑣，均要設定若干濃度和重復，以保證結果的可信度。人工飼料浸藥法是本研究室發(fā)明的一種檢測二化螟抗藥性的新方法，具有操作簡便，快速、準確以及可充分反映各種藥劑的毒力和活性的優(yōu)點，但對于濃度和重復問題仍然與傳統(tǒng)方法一樣，沒有改進。但是利用本發(fā)明的人工飼料浸藥法的診斷劑量進行二化螟田間種群抗藥性檢測，不僅利用了人工飼料浸藥法的優(yōu)點，而且在診斷劑量下，在蟲量較少的情況下仍可快速檢測二化螟抗藥性，解決了傳統(tǒng)毒力測定實驗步驟繁瑣、費時費工以及用蟲量大的弊端，提高了效率。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便，能夠充分反映藥劑毒力，適用于快速檢測二化螟田間種群抗性水平的方法。

為了實現本發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種檢測二化螟抗藥性的方法，在人工飼料浸藥法的診斷劑量下制作帶藥的人工飼料，檢測二化螟田間種群對藥劑的抗性水平，所述藥劑為三唑磷、殺蟲單、阿維菌素和氯蟲苯甲酰胺，各藥劑的診斷劑量：阿維菌素為1.502mg/l，殺蟲單為38.8334mg/l，三唑磷為20.9033mg/l，氯蟲苯甲酰胺為20.2148mg/l。

其中各藥劑的診斷劑量是通過不同濃度的藥劑采用人工飼料浸藥法對室內飼養(yǎng)的二化螟敏感種群進行毒力測定，計算lc99作為藥劑的診斷劑量。

進一步地，藥劑的診斷劑量是通過如下步驟確定的：

(1)二化螟室內敏感種群：在室內一直在未接觸任何藥劑的條件下，以人工飼料飼養(yǎng)至40余代，且采用單卵塊篩選敏感性篩選了3代次的二化螟種群；

(2)采用二甲基甲酰胺溶解和稀釋三唑磷、阿維菌素和氯蟲苯甲酰胺為5-7個不同的濃度作為毒力測定濃度；采用蒸餾水溶解和稀釋殺蟲單為5-7個不同的濃度作為毒力測定濃度；

(3)人工飼料制備：

①a相的制備：在1000ml水中加入135克麥胚粉、120克蔗糖、45克纖維素、155克酪蛋白和20克酵母粉，攪拌均勻后置于自動蒸汽滅菌器中124℃滅菌30分鐘；將180克瓊脂放入2000毫升水中，于微波爐中煮熔為止，將煮熔的瓊脂溶液加入至上述滅菌后的飼料中并攪拌均勻；

②b相的制備：把15克對羥基苯甲酸丙酯鈉、15克山梨酸鉀、2.5克氯霉素、4克韋氏鹽、30克加強維生素混合液、4克氯化膽堿、7毫升40％甲醛、10毫升菜子油和5克膽固醇放入含1000毫升滅菌水的燒杯中，在磁力攪拌器上攪拌溶解20分鐘；

③待a相的溫度下降至60℃時加入b相并攪拌均勻，然后分裝于無菌鋁盒中，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

(4)帶藥人工飼料制備：把步驟(3)制備的人工飼料切成長度1.5cm×寬度1.5cm×厚度1.2mm的薄片，將薄片挑入步驟2制備的不同藥液中浸漬10s后撈出，置于與水平面呈45度的不銹鋼絲網面上晾干30min，吸去多余藥液后，將帶藥的人工飼料薄片挑入到直徑3cm×高9cm的平底玻璃管中；

(5)毒力測定：將4齡2日齡敏感二化螟幼蟲挑入至步驟(4)中的帶藥人工飼料的玻璃管中，每個濃度處理10頭，進行4次生物學重復；

(6)結果及診斷劑量：三唑磷、殺蟲單和阿維菌素三種藥劑均在藥劑處理后48h檢查各濃度處理的幼蟲死亡數，氯蟲苯甲酰胺在藥劑處理后96h檢查各濃度處理的幼蟲死亡數；死亡標準：以尖銳鑷子輕觸蟲體，不能正常爬行者視作為死亡個體；以對照死亡率小于10％為有效測定，并用對照死亡率進行校正，對步驟(5)的結果做毒力回歸線，并計算lc99得出各個藥劑的診斷劑量。

本發(fā)明的有益效果在于：

①本發(fā)明使用的人工飼料，與其他配方中需要活體材料(例如茭白，水稻或小麥)的二化螟人工飼料不同，本配方中所需的材料均可隨時在市場上購買獲得，確保試驗可隨時開展。

②將人工飼料薄片浸漬在藥液中后，藥劑便粘附在人工飼料薄片上，由于幼蟲在浸藥后的人工飼料中爬行和取食，因此，該法可以同時檢測藥劑的胃毒和觸殺活性，可以充分反映殺蟲劑的毒力。

③人工飼料在2個小時內即可制備完成，藥劑處理后2-4天即可獲得試驗結果，具有快速性的特點。

④該測定方法所需設備簡單，無需精密儀器；試驗操作簡便，基層技術人員也易于掌握應用，具有良好的實用性。

⑤應用人工飼料浸藥法診斷劑量檢測二化螟抗藥性的方法，克服了傳統(tǒng)生測方法用蟲量大，操作繁瑣、費時費工等缺點，且可以在蟲量較少的情況下，快速檢測二化螟田間種群抗性水平，明確二化螟的抗性水平，指導田間用藥。

具體實施方式

以下通過具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，并結合相應試驗進一步說明本發(fā)明的有益效果。但本發(fā)明的內容并不局限于此，不能因此而理解為對本發(fā)明范圍的限制。

實施例1診斷劑量的獲得

1.研究對象

本發(fā)明的研究對象為在實驗室內未接觸任何藥劑的條件下以人工飼料飼養(yǎng)40余代且采用單卵塊篩選敏感性篩選了3代次的敏感二化螟種群。

2.方法

2.1供試藥劑：三唑磷、阿維菌素和氯蟲苯甲酰胺用二甲基甲酰胺溶解和稀釋為5-7個不同濃度作為毒力測定濃度備用；殺蟲單用蒸餾水溶解和稀釋為5-7個不同濃度作為毒力測定濃度備用。

2.2人工飼料的制備：

①a相的制備：在1000ml水中加入135克麥胚粉、120克蔗糖、45克纖維素、155克酪蛋白和20克酵母粉，攪拌均勻后置于自動蒸汽滅菌器中124℃滅菌30分鐘；將180克瓊脂放入2000毫升水中，于微波爐中煮熔為止，將煮熔的瓊脂溶液加入至上述滅菌后的飼料中并攪拌均勻；

②b相的制備：把15克對羥基苯甲酸丙酯鈉、15克山梨酸鉀、2.5克氯霉素、4克韋氏鹽、30克加強維生素混合液、4克氯化膽堿、7毫升40％甲醛、10毫升菜子油和5克膽固醇放入含1000毫升滅菌水的燒杯中，在磁力攪拌器上攪拌溶解20分鐘；

③待a相的溫度下降至60℃時加入b相并攪拌均勻，然后分裝于無菌鋁盒中，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

2.3帶藥人工飼料制備：將2.2中制備的人工飼料切成長度1.5cm×寬度1.5cm×厚度1.2mm的薄片，把薄片挑入至2.1制備的不同濃度藥液中浸漬10s后撈出，置于與水平面呈45度的不銹鋼絲網面上晾干30min，吸去多余藥液后，將帶藥的人工飼料薄片挑入到直徑3cm高9cm的平底玻璃管中。

2.4毒力測定：將4齡2日齡敏感二化螟幼蟲挑入至2.3中含帶藥人工飼料的玻璃管中，每個濃度處理10頭，至少進行4次生物學重復。

2.5檢查結果及死亡標準：三唑磷、殺蟲單和阿維菌素3種藥劑均在藥劑處理后48h檢查各濃度處理的幼蟲死亡數，氯蟲苯甲酰胺在藥劑處理后96h檢查各濃度處理的幼蟲死亡數。死亡標準：以尖銳鑷子輕觸蟲體，不能正常爬行者視作為死亡個體。以對照死亡率小于10％為有效測定，并用對照死亡率進行校正。數據采用dps軟件處理，4種殺蟲劑對二化螟的毒力測定結果見表1。計算lc99,即得出各個藥劑的診斷劑量。該診斷劑量可用于快速檢測二化螟田間種群對三唑磷、阿維菌素、氯蟲苯甲酰胺和殺蟲單的抗性水平。

表1四種藥劑對二化螟的毒力測定結果

藥劑的診斷劑量：阿維菌素為1.502mg/l，殺蟲單為38.8334mg/l，三唑磷為20.9033mg/l，氯蟲苯甲酰胺為20.2148mg/l。

實施例2診斷劑量對二化螟田間種群的抗藥性檢測

1檢測對象

本檢測對象為待測二化螟田間種群。從田間采集二化螟卵塊，將孵化的二化螟幼蟲置于人工飼料上飼養(yǎng)到4齡待測。

2方法

供試藥劑三唑磷、阿維菌素、氯蟲苯甲酰胺和殺蟲單，利用本發(fā)明診斷劑量進行二化螟田間種群抗性檢測。

2.1原藥母液的配置及稀釋

將三唑磷、阿維菌素和氯蟲苯甲酰胺原藥用二甲基甲酰胺溶解和稀釋得到診斷劑量備用，殺蟲單原藥用蒸餾水溶解和稀釋得到診斷劑量備用。

2.2人工飼料的制備：

①a相的制備：在1000ml水中加入135克麥胚粉、120克蔗糖、45克纖維素、155克酪蛋白和20克酵母粉，攪拌均勻后置于自動蒸汽滅菌器中124℃滅菌30分鐘；將180克瓊脂放入2000毫升水中，于微波爐中煮熔為止，將煮熔的瓊脂溶液加入至上述滅菌后的飼料中并攪拌均勻；

②b相的制備：把15克對羥基苯甲酸丙酯鈉、15克山梨酸鉀、2.5克氯霉素、4克韋氏鹽、30克加強維生素混合液、4克氯化膽堿、7毫升40％甲醛、10毫升菜子油和5克膽固醇放入含1000毫升滅菌水的燒杯中，在磁力攪拌器上攪拌溶解20分鐘；

③待a相的溫度下降至60℃時加入b相并攪拌均勻，然后分裝于無菌鋁盒中，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

2.3含診斷劑量藥劑的帶藥人工飼料制備：將2.2中制備的人工飼料切成長度1.5cm×寬度1.5cm×厚度1.2mm的薄片，把薄片挑入2.1制備的不同藥劑的診斷劑量藥液中浸漬10s后撈出，置于與水平面呈45度的不銹鋼絲網面上晾干30min，吸去多余藥液后，將帶藥的人工飼料薄片挑入到直徑3cm×高9cm的平底玻璃管中備用。

2.4抗性診斷：將田間二化螟種群的4齡2日齡幼蟲挑入至含有2.3中制備的帶藥人工飼料的玻璃管中，每個藥劑處理40頭。三唑磷、殺蟲單和阿維菌素3種藥劑均在藥劑處理后48h檢查幼蟲死亡數，氯蟲苯甲酰胺在藥劑處理后96h檢查幼蟲死亡數。死亡標準：以尖銳鑷子輕觸蟲體，不能正常爬行者視作為死亡個體。死亡率小于99％的種群為抗性種群。

實施例3人工飼料浸藥診斷劑量法與傳統(tǒng)點滴法對二化螟田間種群抗藥性測定比較

傳統(tǒng)點滴法，需要精密的點滴儀器，操作步驟繁瑣，每次生測重復操作步驟，且用蟲量大。采用本發(fā)明的診斷劑量，制備帶藥人工飼料，用蟲量少，且簡便快速地檢測田間種群抗藥性。

被測試二化螟種群為：江西省南昌縣種群、大余縣種群和鄱陽縣種群。點滴法測定得到3個被測種群對3種藥劑(三唑磷、阿維菌素和殺蟲單)的lc50，見表2。同時采用本發(fā)明的診斷劑量對3個被測種群進行以上3種藥劑的抗性診斷，操作方法如實施例2，各種群在各藥劑診斷劑量下的死亡率見表2。

表23種藥劑的抗藥性測定結果

(抗性倍數＝田間種群ld50/敏感種群ld50，敏感種群點滴法ld50見曹明章，2004)

由表2中數據可以看出，人工飼料浸藥診斷劑量法測定的死亡率與傳統(tǒng)點滴法測定得到的抗性水平具有明顯的相關性，即表示本發(fā)明的診斷劑量可以檢測二化螟田間種群抗性水平，且該方法克服了傳統(tǒng)生測方法所需用蟲量大，操作繁瑣、費工費時等缺陷，更適用于大規(guī)模田間抗性檢測。

雖然上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對其作一些改進，這對本領域的技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。