本發(fā)明涉及一種檢測維生素c發(fā)酵液中葡萄糖酸含量的方法，特別是一種采用高效液相色譜法檢測維生素c發(fā)酵液中葡萄糖酸含量的方法。
背景技術(shù)：
：維生素c又稱l-抗壞血酸，是人體必需的維生素，生理作用廣泛，在醫(yī)藥和食品工業(yè)中均占有重要地位。目前國內(nèi)普遍采用我國自主研發(fā)的“二步發(fā)酵法”生產(chǎn)，“二步發(fā)酵法”的第一步是單菌發(fā)酵，將d-山梨醇轉(zhuǎn)化成l-山梨糖；第二步是混合菌發(fā)酵，通過普通生酮基古龍酸菌(俗稱小菌)和巨大芽孢桿菌(俗稱大菌)的共同作用將l-山梨糖轉(zhuǎn)化成2-酮基-l-古龍酸(2-kga)。2-酮基-l-古龍酸再經(jīng)過提取和轉(zhuǎn)化生成維生素c。為改善“二步發(fā)酵法”維生素c生產(chǎn)工藝第一、二步發(fā)酵效果，研究人員在培養(yǎng)基中加入葡萄糖，但葡萄糖有可能在發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化成葡萄糖酸，從而對發(fā)酵帶來一系列影響，為此需要迅速、準確地測定發(fā)酵液中葡萄糖酸的含量，以便采取針對性措施提高改善發(fā)酵效果，而“二步發(fā)酵法”維生素c生產(chǎn)工藝第一步單菌發(fā)酵發(fā)酵液中含有山梨醇和山梨糖，第二步混合菌發(fā)酵發(fā)酵液中含有山梨糖和古龍酸，這些物質(zhì)與葡萄糖、葡萄糖酸性質(zhì)相近，分離十分困難，常規(guī)的化學分析方法很難快速進行分析測定，因此需要建立一種新的專用檢測方法，以快速、準確、方便地測定維生素c發(fā)酵液中葡萄糖酸的含量。經(jīng)檢索，未見有專用的、檢測維生素c發(fā)酵液中葡萄糖酸含量的方法的公開報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種專用的、采用高效液相色譜法檢測維生素c發(fā)酵液中葡萄糖酸含量的方法，以快速、準確、方便地測定維生素c發(fā)酵液中葡萄糖酸的含量。本發(fā)明的目的可以通過這樣的技術(shù)方案來實現(xiàn)：一種采用高效液相色譜法檢測維生素c發(fā)酵液中葡萄糖酸含量的方法，它采用如下色譜條件：色譜柱：氨基色譜柱檢測器：紫外檢測器流動相：體積比為40:60～60:40的磷酸鹽緩沖溶液與乙腈混合液，其中磷酸鹽緩沖溶液濃度為1～4‰流速：0.5～1.5ml/min柱溫：20～40℃檢測波長：205～215nm進樣量：20μl是按下列步驟測定維生素c發(fā)酵液中葡萄糖酸含量的：一、制備供檢發(fā)酵液溶液：精密量取維生素c發(fā)酵液mml，注入容量瓶中，加流動相稀釋至10倍體積，搖勻，過濾，制成供檢發(fā)酵液溶液；二、制備對照品溶液：精密稱取葡萄糖酸標準品nmg，加入容量瓶中，加流動相，溶解搖勻，過濾，制成1mg/ml的液體，作為對照品溶液；三、取供檢發(fā)酵液溶液注入液相色譜儀，和對照品溶液按照本方法的色譜條件進樣，按外標法計算供檢發(fā)酵液中葡萄糖酸的含量，即得維生素c發(fā)酵液中葡萄糖酸的含量。本發(fā)明所提供的這種檢測維生素c發(fā)酵液中葡萄糖酸含量的方法，優(yōu)選色譜條件：流動相的磷酸鹽緩沖溶液濃度為2‰，磷酸鹽緩沖溶液與乙腈的體積比為50:50，流速為1.0ml/min，柱溫為30℃，檢測波長為210nm。本發(fā)明所提供的這種檢測維生素c發(fā)酵液中葡萄糖酸含量的方法，程序簡單，易操作，由于山梨醇和葡萄糖在本方法中沒有響應(yīng)，不會產(chǎn)生干擾，而山梨糖、古龍酸與葡萄糖酸在本方法中可以得到有效分離，因此具有重現(xiàn)性強、靈敏度高、準確度高等優(yōu)點，可以快速、準確地測定維生素c發(fā)酵液中葡萄糖酸的含量，為提高“二步發(fā)酵法”維生素c生產(chǎn)工藝發(fā)酵收率的研究提供指導(dǎo)。附圖說明圖1為在本發(fā)明實施例的方法色譜條件下，山梨糖、古龍酸與葡萄糖酸的混合液的液相色譜圖。具體實施方式為了更好地說明本發(fā)明，舉出以下實施例和驗證例，但本發(fā)明的保護范圍并不僅僅局限于此，其要求保護的范圍記載于權(quán)利要求的權(quán)項中。實施例本發(fā)明實施例提供一種采用高效液相色譜法檢測維生素c發(fā)酵液中葡萄糖酸含量的方法，它采用如下色譜條件：色譜柱：lc-nh2250mm×4.6mm色譜柱(氨基色譜柱)檢測器：紫外檢測器流動相：體積比為50:50的磷酸鹽緩沖溶液與乙腈混合液，其中磷酸鹽緩沖溶液濃度為2‰流速：1.0ml/min柱溫：30℃檢測波長：210nm進樣量：20μl是按下列步驟測定維生素c發(fā)酵液中葡萄糖酸含量的：一、制備供檢發(fā)酵液溶液：精密量取三批“二步發(fā)酵法”維生素c生產(chǎn)工藝第一步單菌發(fā)酵發(fā)酵液各1份，各5.0ml；三批“二步發(fā)酵法”維生素c生產(chǎn)工藝第二步混合菌發(fā)酵發(fā)酵液各1份，各5.0ml，注入不同的50ml容量瓶中，加流動相稀釋至刻度(50ml)，搖勻，過濾，制成6份供檢發(fā)酵液溶液；二、制備對照品溶液：精密稱取葡萄糖酸標準品50mg，加入50ml容量瓶中，加流動相至刻度(50ml)，溶解搖勻，過濾，制成1mg/ml的液體，作為對照品溶液；三、分別取各供檢發(fā)酵液溶液注入液相色譜儀，和對照品溶液按照本方法的色譜條件進樣，按外標法計算供檢發(fā)酵液中葡萄糖酸的含量，即得維生素c發(fā)酵液中葡萄糖酸的含量，結(jié)果見表1。表1：維生素c發(fā)酵液中葡萄糖酸含量的測定結(jié)果批號含量(mg/ml)第一批“二步發(fā)酵法”維生素c生產(chǎn)工藝第一步單菌發(fā)酵發(fā)酵液10.18第二批“二步發(fā)酵法”維生素c生產(chǎn)工藝第一步單菌發(fā)酵發(fā)酵液10.43第三批“二步發(fā)酵法”維生素c生產(chǎn)工藝第一步單菌發(fā)酵發(fā)酵液10.21第一批“二步發(fā)酵法”維生素c生產(chǎn)工藝第二步混合菌發(fā)酵發(fā)酵液5.12第二批“二步發(fā)酵法”維生素c生產(chǎn)工藝第二步混合菌發(fā)酵發(fā)酵液5.03第三批“二步發(fā)酵法”維生素c生產(chǎn)工藝第二步混合菌發(fā)酵發(fā)酵液5.23驗證例1、分離度色譜條件：同實施例實驗方法：精密稱取山梨糖、古龍酸、葡萄糖酸標準品各50mg，加入50ml容量瓶中，加流動相至刻度(50ml)，溶解搖勻，過濾，制成山梨糖、古龍酸和葡萄糖酸含量各為1mg/ml的混合液，然后將上述混合液注入液相色譜儀，按照本方法實施例的色譜條件進樣，記錄色譜圖，見附圖1，山梨糖色譜峰保留時間為2.72分鐘，古龍酸色譜峰保留時間為17.5分鐘，葡萄糖酸色譜峰保留時間為19.4分鐘，三種物質(zhì)分離度良好，均在2以上。實驗結(jié)果表明：在本方法的實施過程中，山梨糖、古龍酸、葡萄糖酸三種物質(zhì)能夠得到有效分離。2、線性試驗色譜條件：同實施例實驗方法：精密稱取葡萄糖酸標準品200mg，加入100ml容量瓶中，加流動相至刻度(100ml)，溶解搖勻，過濾，作為儲備液。再向上述儲備液中加流動相，按1倍、1.25倍、2倍、4倍、8倍、16倍稀釋，分別制成1、2、3、4、5、6號葡萄糖酸標準品溶液，然后分別取各葡萄糖酸標準品溶液注入液相色譜儀，按照本方法實施例的色譜條件進樣，以峰面積及濃度作圖，進行線性回歸，得標準曲線方程，峰面積a＝0.424*c-10.95，相關(guān)系數(shù)r＝0.9995。實驗結(jié)果表明：葡萄糖酸在120～2000ug/ml的范圍內(nèi)，峰面積與進樣量有良好的線性關(guān)系。3、回收率色譜條件：同實施例一、精密量取已知葡萄糖酸含量的“二步發(fā)酵法”維生素c生產(chǎn)工藝第一步單菌發(fā)酵發(fā)酵液6份，各5.0ml，注入不同的50ml容量瓶中，然后再精密稱取葡萄糖酸標準品6份，各30mg，分別加入上述的50ml容量瓶中，加流動相至各50ml容量瓶刻度(50ml)，溶解搖勻，過濾，制成1、2、3、4、5、6號供檢發(fā)酵液溶液；二、精密稱取葡萄糖酸標準品50mg，加入50ml容量瓶中，加流動相至刻度(50ml)，溶解搖勻，過濾，制成1mg/ml的液體，作為對照品溶液；三、分別取各供檢發(fā)酵液溶液注入液相色譜儀，和對照品溶液按照本方法實施例的色譜條件進樣，按外標法計算葡萄糖酸的回收率，結(jié)果如表2所示。表2：回收率測定結(jié)果回收率：98.1～101.9％，平均回收率為99.6％，rsd為1.3％。實驗結(jié)果表明：本方法的回收率良好，準確度高。4、重復(fù)性色譜條件：同實施例一、精密量取同一批“二步發(fā)酵法”維生素c生產(chǎn)工藝第一步單菌發(fā)酵發(fā)酵液6份，各5.0ml，注入不同的50ml容量瓶中，加流動相稀釋至刻度(50ml)，搖勻，過濾，制成7、8、9、10、11、12號供檢發(fā)酵液溶液；二、精密稱取葡萄糖酸標準品50mg，加入50ml容量瓶中，加流動相至刻度(50ml)，溶解搖勻，過濾，制成1mg/ml的液體，作為對照品溶液；三、分別取各供檢發(fā)酵液溶液注入液相色譜儀，和對照品溶液按照本方法實施例的色譜條件進樣，按外標法計算供檢發(fā)酵液中葡萄糖酸的含量，結(jié)果見表3。表3：供檢發(fā)酵液重復(fù)性的檢測結(jié)果組別789101112rsd(％)含量(mg/ml)10.1810.2410.3210.4610.2710.390.99重復(fù)性試驗rsd值為0.99％，小于2.0％。實驗結(jié)果表明：本方法的重復(fù)性好。結(jié)論：本發(fā)明所提供的采用高效液相色譜法檢測維生素c發(fā)酵液中葡萄糖酸含量的方法專屬性強、靈敏度高、精密度好，能夠快速、準確地測定維生素c發(fā)酵液中葡萄糖酸的含量。當前第1頁12