本發(fā)明涉及生化檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種借助于測(cè)定材料的化學(xué)物理性質(zhì)來測(cè)定材料的試劑盒。

背景技術(shù)：

同型半胱氨酸(又稱高半胱氨酸，homocysteine,hcy)是蛋氨酸代謝過程中的中間產(chǎn)物。同型半胱氨酸在體內(nèi)的分解代謝，受兩方面因素影響最大。一是與先天遺傳有關(guān)的某些生物酶的缺乏，另一個(gè)就是體內(nèi)葉酸、維生素b6、維生素b12等營養(yǎng)元素的缺乏。這兩種缺乏都會(huì)影響同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥。hcy的測(cè)定，對(duì)心血管疾病、尿毒癥、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、老年癡呆癥等疾病的判定中，有重要的臨床意義。

血漿中的同型半胱氨酸約70％與白蛋白結(jié)合，為結(jié)合型。其余的游離型則主要以二硫同型半胱氨酸和以二硫鍵結(jié)合的同型半胱氨酸-半胱氨酸化合物形式存在，只有少量以還原型同型半胱氨酸存在于血漿中。我們通常所指的是總的同型半胱氨酸濃度。

影響同型半胱氨酸水平最主要的因素莫過于遺傳于食物營養(yǎng)缺乏。遺傳因素主要包括n5甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)甲基酶及胱硫醚-β-合成酶的基因發(fā)生突變，引起酶的活性降低，從而導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥?，F(xiàn)在已經(jīng)證明n5甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)甲基酶的缺陷，在體內(nèi)葉酸缺乏的情況下，可以引起同型半胱氨酸濃度的明顯升高。而根據(jù)mudd等的研究，由遺傳缺陷引起的胱硫醚-β-合成酶的活性降低，可導(dǎo)致血漿中同型半胱氨酸的濃度超過正常值的十倍左右。

對(duì)近1200名老人的研究表明，體內(nèi)同型半胱氨酸的水平與飲食有著密切的關(guān)系，血漿中維生素b6、b12和葉酸的濃度越低，其同型半胱氨酸的濃度越高。由于動(dòng)物蛋白中蛋氨酸的含量比植物蛋白約高三倍左右，可以產(chǎn)生較多的同型半胱氨酸，因此可對(duì)人體的動(dòng)脈組織造成損傷。

其它因素包括性別、年齡、腎功能的損害、以及服用影響葉酸和b族維生素的藥物，都可影響同型半胱氨酸的水平。尤其是腎功的損害，會(huì)嚴(yán)重影響那些含硫氨基酸的排出，因?yàn)槟I小管內(nèi)皮細(xì)胞的胱硫醚-β-合成酶對(duì)同型半胱氨酸的轉(zhuǎn)化作用，被認(rèn)為血液中的非蛋白結(jié)合型同型半胱氨酸很重要的代謝途徑。

通常認(rèn)為成人空腹血漿總hcy水平正常值為4～12μmol/l，理想值為<10μmol/l，高于15μmol/l則被認(rèn)為是高同型半胱氨酸敗血癥；老年人(≥60歲)空腹血漿總hcy水平正常值為15～20μmol/l，高于20μmol/l被認(rèn)為是高同型半胱氨酸敗血癥。

目前，實(shí)驗(yàn)室常用的hcy測(cè)定方法有色譜法、酶聯(lián)免疫法及熒光偏振免疫法。色譜法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在公認(rèn)其為測(cè)定血漿hcy濃度的首選方法，但因色譜法(hplc及gc-ms)需要的設(shè)備復(fù)雜且昂貴，難以適應(yīng)常規(guī)臨床化學(xué)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，而酶聯(lián)免疫測(cè)定法可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，且可測(cè)定大量標(biāo)本，因此受到臨床廣泛歡迎。

酶聯(lián)免疫法檢測(cè)同型半胱氨酸的原理是基于小分子捕獲技術(shù)(smt)的s-腺苷同型半胱氨酸水解酶。hcy被轉(zhuǎn)化為游離型后，通過與共價(jià)底物反應(yīng)，循環(huán)放大，同時(shí)產(chǎn)生腺苷。腺苷立即水解成氨和次黃嘌呤，氨在谷氨酸脫氫酶的作用下，使nadh轉(zhuǎn)化為nad，樣本中的hcy濃度與nadh轉(zhuǎn)化速率成正比。

酶免疫檢測(cè)法是一種無需預(yù)處理樣本，技術(shù)和設(shè)備要求不高，而精密度和特異性更高的分析方法，由于該方法不需要昂貴的設(shè)備，可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，且可測(cè)定大量標(biāo)本，因此受到臨床廣泛推廣。但是普通的同型半胱氨酸檢測(cè)試劑中由于存在多種酶，會(huì)使該試劑的穩(wěn)定性受到影響，不利于試劑的長期保存，從而造成浪費(fèi)的不良后果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種穩(wěn)定性高、準(zhǔn)確度和精密度高的同型半胱氨酸檢測(cè)試劑盒及其使用方法。

本發(fā)明涉及一種同型半胱氨酸檢測(cè)試劑盒及其使用方法，所述同型半胱氨酸檢測(cè)試劑盒包括試劑1和試劑2；

所述試劑1包括：

所述試劑2包括：

所述胱硫醚-β-合成酶和蛋氨酸合成酶的酶的比活力相同，胱硫醚-β-裂解酶和蛋氨酸-γ裂解酶的酶的比活力相同。

優(yōu)選地，所述復(fù)合穩(wěn)定劑包括吐溫8010～13g/l，谷氨酸20～30g/l，谷胱甘肽1～3g/l，海藻糖50～60g/l，十二烷基二甲基甜菜堿2～6g/l，卵磷脂3～6g/l，緩沖液100～120mmol/l；其為申請(qǐng)?zhí)枮?01610166107.2的多種抗體的復(fù)合穩(wěn)定劑及其使用方法中的復(fù)合穩(wěn)定劑。

優(yōu)選地，所述試劑1包括：

所述試劑2包括：

所述胱硫醚-β-合成酶和蛋氨酸合成酶的酶的比活力相同，胱硫醚-β-裂解酶和蛋氨酸-γ裂解酶的酶的比活力相同。

本發(fā)明試劑盒采用胱硫醚循環(huán)酶法檢測(cè)血清樣本中同型半胱氨酸的含量。樣本中原先存在的氧化型hcy被還原成游離型hcy，其與絲氨酸(serine)被胱硫醚β-合成酶(cbs)催化形成l-胱硫醚，其在胱硫醚β-分解酶(cbl)作用下生成游離型hcy、丙酮酸、氨，新生成的hcy不斷加入該循環(huán)反應(yīng)，產(chǎn)生的丙酮酸在乳酸脫氫酶(ldh)的作用下，將nadh轉(zhuǎn)化為nad⁺，樣本中的hcy濃度與nadh的變化呈正比。反應(yīng)方程式如圖1所示。

本發(fā)明還涉及一種同型半胱氨酸檢測(cè)試劑盒的使用方法，

該試劑盒的測(cè)定方法為速率法；

(1)將240份試劑1和10份待測(cè)樣品，37℃孵育后得到反應(yīng)液1；

(2)然后加入60份試劑2混合均勻，37℃孵育后得到反應(yīng)液2；

(3)延遲時(shí)間為150s，測(cè)定反應(yīng)液2的吸光度a1，5min后再次測(cè)反應(yīng)液2的吸光度a2，測(cè)定主波長為340nm、副波長為405nm；

(4)用步驟(1)-(3)的操作對(duì)同型半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度進(jìn)行測(cè)定，分別得到吸光度a3和a4；

(5)用吸光度差值進(jìn)行計(jì)算，根據(jù)式1計(jì)算血清總同型半胱氨酸濃度；

式1：

同型半胱氨酸濃度＝△a樣品/δa標(biāo)準(zhǔn)液×標(biāo)準(zhǔn)液濃度；

△a樣品＝|a2-a1|；

δa標(biāo)準(zhǔn)液＝|a4-a3|；

上述份數(shù)均為體積份數(shù)。

本發(fā)明同型半胱氨酸檢測(cè)試劑盒及其使用方法與現(xiàn)有技術(shù)不同之處在于：

1、本發(fā)明試劑盒采用的緩沖液capso為good's系列，是一種兩性離子緩沖液，其主要優(yōu)點(diǎn)是不參與和不干擾生物化學(xué)反映過程，且對(duì)酶化反應(yīng)等無抑制作用。試劑1中加入的還原劑tcep(三(2-羧乙基)膦)和巰基乙醇共同作用于氧化型hcy，將其充分還原；加入的抗壞血酸氧化酶可以減少樣本中的維生素c的干擾，加入的還原性輔酶thio-nadh，作為反應(yīng)物，對(duì)于本試劑中的關(guān)鍵酶具有較好的親和性，促進(jìn)該反應(yīng)體系，優(yōu)于nadh，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

2、本發(fā)明試劑盒的試劑2中添加的多種混合酶(cbs、蛋氨酸合成酶、胱硫醚-β-裂解酶(cbl)和蛋氨酸-γ裂解酶可以提高本發(fā)明試劑盒關(guān)于同型半胱氨酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性，同時(shí)加入的穩(wěn)定劑和復(fù)合穩(wěn)定劑能夠發(fā)揮協(xié)同作用，提高酶試劑的穩(wěn)定性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明同型半胱氨酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)原理的反應(yīng)方程式；

圖2為本發(fā)明同型半胱氨酸檢測(cè)試劑盒與對(duì)照試劑盒的相關(guān)性測(cè)試結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明同型半胱氨酸檢測(cè)試劑盒校準(zhǔn)曲線；

圖4為本發(fā)明同型半胱氨酸檢測(cè)試劑盒校準(zhǔn)反應(yīng)曲線圖。

具體實(shí)施方式

通過以下實(shí)施例和驗(yàn)證試驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的同型半胱氨酸檢測(cè)試劑盒及其使用方法作進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1

本實(shí)施例的同型半胱氨酸檢測(cè)試劑盒原料及配比如下：

試劑1包括：

試劑2包括：

其中，胱硫醚-β-合成酶和蛋氨酸合成酶的酶的比活力相同，胱硫醚-β-裂解酶和蛋氨酸-γ裂解酶的酶的比活力相同。

實(shí)施例2

本實(shí)施例的同型半胱氨酸檢測(cè)試劑盒原料及配比如下：

試劑1包括：

試劑2包括：

其中，胱硫醚-β-合成酶和蛋氨酸合成酶的酶的比活力相同，胱硫醚-β-裂解酶和蛋氨酸-γ裂解酶的酶的比活力相同。

實(shí)施例3

本實(shí)施例的同型半胱氨酸檢測(cè)試劑盒原料及配比如下：

試劑1包括：

試劑2包括：

本發(fā)明同型半胱氨酸檢測(cè)試劑盒校準(zhǔn)曲線如圖3所示；本發(fā)明同型半胱氨酸檢測(cè)試劑盒校準(zhǔn)反應(yīng)曲線如圖4所示。

其中，胱硫醚-β-合成酶和蛋氨酸合成酶的酶的比活力相同，胱硫醚-β-裂解酶和蛋氨酸-γ裂解酶的酶的比活力相同。

驗(yàn)證試驗(yàn)

以上實(shí)施例中制得的產(chǎn)品使用方法如下：

該試劑盒的測(cè)定方法為速率法；

(1)將240份試劑1和10份待測(cè)樣品，37℃孵育后得到反應(yīng)液1；

(2)然后加入60份試劑2混合均勻，37℃孵育后得到反應(yīng)液2；

(3)延遲時(shí)間為150s，測(cè)定反應(yīng)液2的吸光度a1，5min后再次測(cè)反應(yīng)液2的吸光度a2，測(cè)定主波長為340nm、副波長為405nm；

(4)用步驟(1)-(3)的操作對(duì)同型半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度進(jìn)行測(cè)定，分別得到吸光度a3和a4；

(5)用吸光度差值進(jìn)行計(jì)算，根據(jù)式1計(jì)算血清總同型半胱氨酸濃度；

式1：

同型半胱氨酸濃度＝△a樣品/δa標(biāo)準(zhǔn)液×標(biāo)準(zhǔn)液濃度；

△a樣品＝|a2-a1|；

δa標(biāo)準(zhǔn)液＝|a4-a3|；

上述份數(shù)均為體積份數(shù)。

對(duì)上述實(shí)施例1～3中的產(chǎn)品進(jìn)行測(cè)試，并與其他公司同類型產(chǎn)品進(jìn)行對(duì)比，其中對(duì)照試劑盒為一國內(nèi)市售同型半胱氨酸檢測(cè)試劑盒，其主要成分為：試劑1：乳酸脫氫酶(ldh)、絲氨酸(ser)、nadh。試劑2：胱硫醚β-合成酶(cbs)、胱硫醚β-分解酶(cbl)、穩(wěn)定劑。

測(cè)試1

重復(fù)性測(cè)試：用貝克曼au480全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清樣本，重復(fù)測(cè)定10次，與對(duì)照試劑盒相比較，結(jié)果如下表。

表1重復(fù)性測(cè)試結(jié)果(μmol/l)

由結(jié)果可以看出：本試劑盒測(cè)定的變異系數(shù)cv％＝0.98％，小于10％，符合本試劑技術(shù)要求，且小于對(duì)照試劑盒的1.56％，表明本試劑盒的重復(fù)性更好。

測(cè)試2

相關(guān)性測(cè)試：使用貝克曼au480生化分析儀進(jìn)行測(cè)定，以本試劑盒與對(duì)照試劑盒為材料，校準(zhǔn)后測(cè)定40例臨床樣本的hcy的含量，結(jié)果可以看出線性回歸方程為y＝1.0054x+0.077，r²＝0.9941，r＝0.9997，表明本試劑盒測(cè)試結(jié)果與對(duì)照試劑所得結(jié)果相關(guān)性良好(如圖2所示)。

測(cè)試3

準(zhǔn)確度測(cè)試：以本試劑盒為材料，校準(zhǔn)后采用高值、中值、低值3個(gè)質(zhì)控水平進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)3次，結(jié)果如表2。

表2準(zhǔn)確度測(cè)試結(jié)果

由結(jié)果可以看出：本試劑盒測(cè)試結(jié)果的相對(duì)偏差都小于±10％，且測(cè)試結(jié)果接近靶值，說明本試劑盒準(zhǔn)確度較好。

雖然以上描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些僅是舉例說明，本發(fā)明的保護(hù)范圍是由所附權(quán)利要求書限定的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的原理和實(shí)質(zhì)的前提下，可以對(duì)這些實(shí)施方式作出多種變更或修改，但這些變更和修改均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。