本發(fā)明屬于理化分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同時(shí)測(cè)定煙堿中11種次要生物堿雜質(zhì)含量的方法。

背景技術(shù)：

煙堿，俗名尼古丁，化學(xué)名稱是1-甲基(2-吡啶基)吡咯烷，分子式為c10h14n2，分子量為162.23。煙堿具有廣泛的生物活性和藥用價(jià)值，在除草劑、殺蟲劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、藥物及藥物中間體的研發(fā)中起到重要的作用，是戒煙產(chǎn)品——煙堿替代療法（nrp）的主要生理活性成分，并在電子煙等新型煙草制品中有大量的應(yīng)用。煙堿作為藥物及消費(fèi)品用途時(shí)，人們對(duì)其品質(zhì)（如純度等）具有一定的要求，如美國電子煙煙油生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)建議電子煙所使用煙堿應(yīng)符合美國藥品級(jí)（usp級(jí)）煙堿的要求，即要求煙堿中單個(gè)雜質(zhì)的含量不超過0.5%，總雜質(zhì)含量不超過1.0%。現(xiàn)有市售煙堿主要來源于煙草提取，其品質(zhì)及純度也參差不齊。因?yàn)榇我飰A和煙堿結(jié)構(gòu)有一定的類似性，在煙堿提取過程中往往難以去除，此外，煙堿也會(huì)在提取、存儲(chǔ)等過程中發(fā)生分解而生成次要生物堿，所以，市售煙堿中往往含有一定濃度的次要生物堿雜質(zhì)，而這些次要生物堿雜質(zhì)是影響煙堿品質(zhì)（如純度等）的主要因素之一。所以，有必要對(duì)煙堿中的次要生物堿含量進(jìn)行分析測(cè)定。但是，現(xiàn)有測(cè)定次要生物堿的研究還存在兩個(gè)不足：一是研究生物堿的基質(zhì)主要是煙草和煙草制品，二是目標(biāo)次要生物堿的數(shù)量比較少，主要是降煙堿、麥斯明、新煙草堿、假木賊堿等，而對(duì)其他次要生物堿的研究較少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的正是基于上述技術(shù)不足，建立了一種同時(shí)測(cè)定煙堿中11種次要生物堿雜質(zhì)含量的方法。本方法不需要復(fù)雜的前處理過程，可同時(shí)測(cè)定煙堿中的11種次要生物堿雜質(zhì)含量，具有操作簡(jiǎn)便、通量高、靈敏度高、回收率及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

一種同時(shí)測(cè)定煙堿中11種次要生物堿雜質(zhì)含量的方法，所述11種次要生物堿分別為：n-甲基假木賊堿、降煙堿、麥斯明、假木賊堿、β-二烯煙堿、新煙草堿、2,3’-聯(lián)吡啶、β-二烯降煙堿、可替寧、哈爾堿、煙臺(tái)林；使用二氯甲烷作為萃取溶劑進(jìn)行萃取，以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量；具體包括以下步驟：

1）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

制備具有12級(jí)濃度梯度的次要生物堿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中，降煙堿的定量采用降煙堿-2,4,5,6-d4作為內(nèi)標(biāo)，其它次要生物堿的定量采用2,2’-聯(lián)吡啶-d8作為內(nèi)標(biāo)；

2）樣品前處理

準(zhǔn)確稱取20mg煙堿于15ml塑料離心管中，再分別加入50μl內(nèi)標(biāo)溶液和10.0ml二氯甲烷，加蓋密封后置于渦旋振蕩器中，以2000rpm的速度渦旋振蕩提取20min后，取萃取液轉(zhuǎn)移到色譜分析瓶中進(jìn)行g(shù)c-ms分析；

3）氣相色譜-質(zhì)譜分析

利用氣相色譜儀配備質(zhì)譜檢測(cè)器對(duì)所制待測(cè)樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行分析，得到相關(guān)色譜圖；

4）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及結(jié)果計(jì)算。

本發(fā)明更具體的說包括以下內(nèi)容：

1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.1內(nèi)標(biāo)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取約100.0mg降煙堿-2,4,5,6-d4和100.0mg2,2’-聯(lián)吡啶-d8于50ml棕色容量瓶中，以甲醇定容，即得內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。降煙堿-2,4,5,6-d4作為降煙堿內(nèi)標(biāo)，而2,2’-聯(lián)吡啶-d8作為其他10種次要生物堿內(nèi)標(biāo)。將內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液以甲醇稀釋5倍，即得到內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

分別準(zhǔn)確稱取約20.0mg次要生物堿，置于10ml的棕色容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度。該溶液應(yīng)在4℃～8℃條件下避光保存。

1.3二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

準(zhǔn)確移取約0.1ml一級(jí)11種次要生物堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于10ml的棕色容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度。該溶液應(yīng)在4℃～8℃條件下避光保存。

1.4標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

分別準(zhǔn)確移取10μl、20μl、50μl、100μl、200μl、500μl的二級(jí)11種次要生物堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及10μl、20μl、50μl、100μl、200μl、500μl的一級(jí)11種次要生物堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于不同的10ml棕色容量瓶中，再分別準(zhǔn)確加入50μl內(nèi)標(biāo)溶液，用二氯甲烷稀釋定容至刻度，即得到12個(gè)不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

儀器分析條件

所述方法的儀器分析條件為：

色譜柱：db-35ms毛細(xì)管色譜柱，固定相：（35%-苯基）-甲基聚硅氧烷，規(guī)格：30m×0.25mm×0.25μm。

進(jìn)樣口溫度：250℃；進(jìn)樣量：1μl；載氣：氦氣（純度≥99.999%），恒流模式，流速：1.0ml/min。

次要生物堿柱升溫程序：不分流進(jìn)樣；溶劑延遲：12min；升溫程序：初始溫度80℃，保持1min，以8℃/min的速率至250℃，保持1min，再以40℃/min的速率至280℃，保持5min。運(yùn)行總時(shí)間為29min。

電離方式：電子轟擊源（ei）；電離能量：70ev；傳輸線溫度：280℃；離子源溫度：250℃；掃描離子范圍：80～250amu；質(zhì)譜掃描方式：選擇離子監(jiān)視方式（sim）掃描，目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間、定量及定性選擇離子參數(shù)如表1所示。

樣品前處理

準(zhǔn)確稱取約20mg煙堿于15ml塑料離心管中，再分別加入50μl內(nèi)標(biāo)溶液和10.0ml二氯甲烷，加蓋密封后置于渦旋振蕩器中，以2000rpm的速度渦旋振蕩提取20min后，取萃取液轉(zhuǎn)移到色譜分析瓶中進(jìn)行g(shù)c-ms分析。

加標(biāo)回收率和精密度

分別按照低、中、高3種水平加入11種煙草次要生物堿標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定5次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由表可知，11種煙草生物堿的加標(biāo)回收率在96.80%~103.70%之間，精密度不高于2.24%。

線性范圍和檢出限

本研究采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，以各目標(biāo)化合物的濃度為橫坐標(biāo)，分析物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。在優(yōu)化條件下，考慮到煙堿中目標(biāo)化合物的濃度范圍，確定了方法的線性范圍，并按照目標(biāo)物信噪比為3時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度作為檢出限，如表3所示。由表可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)不低于0.997，方法檢出限在0.0056~0.12μg/g。

總之，建立了一種同時(shí)測(cè)定煙堿中11種次要生物堿雜質(zhì)的gc-ms高通量檢測(cè)方法。本方法經(jīng)過一次樣品前處理過程即可同時(shí)測(cè)定煙堿中的11種生物堿含量，包括n-甲基假木賊堿、降煙堿、麥斯明、假木賊堿、β-二烯煙堿、新煙草堿、2,3’-聯(lián)吡啶、β-二烯降煙堿、可替寧、哈爾堿、煙臺(tái)林等，方法檢出限在0.0056~0.12μg/g，加標(biāo)回收率在96.80%~103.70%之間，精密度不高于2.24%，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、通量高、回收率及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能為煙堿產(chǎn)品純度測(cè)定、質(zhì)量安全控制等領(lǐng)域提供技術(shù)支持和科學(xué)依據(jù)。

附圖說明

圖1為11種次要生物堿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液選擇離子流圖；

圖中：1：n-甲基假木賊堿；2：降煙堿及降煙堿-2,4,5,6-d4；3：麥斯明；4：2,2’-聯(lián)吡啶-d8；5：假木賊堿；6：β-二烯煙堿；7：新煙草堿；8：2,3’-聯(lián)吡啶；9：β-二烯降煙堿；10：可替寧；11：哈爾堿；12：煙臺(tái)林。

圖2為11種生物堿及其結(jié)構(gòu)式。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明通過以下具體實(shí)施例作進(jìn)一步描述，但不限制本發(fā)明。

實(shí)施例1：

1、儀器及試劑

儀器：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國agilent7890b-5977a型）；ae163電子天平（感量：0.0001g，瑞士mettler公司）；talboys數(shù)顯型多管式旋渦混合器。

試劑耗材：降煙堿由alfa購得，其他10種次要生物堿均由trc購得，降煙堿-2,4,5,6-d4（cdnisotopes），2,2’-聯(lián)吡啶-d8（cdnisotopes），甲醇（duksan，色譜純），二氯甲烷（duksan，色譜純）。

2、樣品前處理

準(zhǔn)確稱取約20mg煙堿于15ml塑料離心管中，再分別加入50μl內(nèi)標(biāo)溶液和10.0ml二氯甲烷，加蓋密封后置于渦旋振蕩器中，以2000rpm的速度渦旋振蕩提取20min后，取萃取液轉(zhuǎn)移到色譜分析瓶中進(jìn)行g(shù)c-ms分析。

3、儀器分析條件

所述方法的儀器分析條件為：

色譜柱：db-35ms毛細(xì)管色譜柱，固定相：（35%-苯基）-甲基聚硅氧烷，規(guī)格：30m×0.25mm×0.25μm；

進(jìn)樣口溫度：250℃；進(jìn)樣量：1μl；載氣：氦氣（純度≥99.999%），恒流模式，流速：1.0ml/min；

次要生物堿柱升溫程序：不分流進(jìn)樣；溶劑延遲：12min；升溫程序：初始溫度80℃，保持1min，以8℃/min的速率至250℃，保持1min，再以40℃/min的速率至280℃，保持5min，運(yùn)行總時(shí)間為29min；

電離方式：電子轟擊源（ei）；電離能量：70ev；傳輸線溫度：280℃；離子源溫度：250℃；掃描離子范圍：80～250amu；質(zhì)譜掃描方式：選擇離子監(jiān)視方式（sim）掃描，目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間、定量及定性選擇離子參數(shù)如表1所示。

根據(jù)上述測(cè)定方法，選擇5種煙堿樣品，測(cè)得11種生物堿含量如下表所示（單位：μg/g）：