本發(fā)明涉及醫(yī)學檢測，具體涉及一種用于結(jié)核感染分型的生物標志物組合、模型及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(mtb)感染導致的嚴重威脅人類健康的重大疾病?；顒有越Y(jié)核的早期診斷是有效治療的基礎(chǔ)，是控制結(jié)核病的關(guān)鍵所在，而潛伏性結(jié)核的篩查可以定位結(jié)核病高風險人群，幫助早期預測結(jié)核病的發(fā)生，在控制結(jié)核病流行中也發(fā)揮了重要作用。因此，尋找能快速區(qū)分活動與潛伏性結(jié)核感染的方法對于控制結(jié)核病疫情具有重要意義。

2、然而，目前的結(jié)核病診斷技術(shù)不能滿足區(qū)分活動與潛伏性結(jié)核感染的臨床需求。例如，抗酸染色敏感性低，用于少菌型結(jié)核以及難取材的肺外結(jié)核時性能進一步降低；分子生物學技術(shù)明顯提高了病原學檢測的敏感性，但在檢測少菌型結(jié)核以及難取材的肺外結(jié)核時敏感性仍然比較差。盡管mtb培養(yǎng)仍是目前結(jié)核病診斷的“金標準”，但耗時長達一月以上，另外，對于少菌型結(jié)核仍然檢測困難，更重要的是，以上病原學檢測技術(shù)只能用于活動性結(jié)核的診斷，而對潛伏性結(jié)核感染無能為力。

3、ifn-γ釋放試驗(igra)是近年來開發(fā)的能用于mtb感染診斷的新技術(shù)。該技術(shù)的原理為，不管是活動還是潛伏性結(jié)核感染者體內(nèi)都存在結(jié)核特異性t細胞，當被mtb抗原致敏的t細胞再次遇到同類抗原時能產(chǎn)生高水平的ifn-γ，因此，可以通過定量檢測受檢者外周血單個核細胞在mtb特異性抗原刺激下釋放的ifn-γ，從而用于活動性與潛伏性結(jié)核感染的診斷。結(jié)核感染t細胞檢測(t-spot.tb)作為igra的代表，是由英國牛津免疫技術(shù)公司研發(fā)的結(jié)核感染診斷試劑盒。該試劑盒使用mtb特異性抗原早期抗原靶6(esat-6)、培養(yǎng)濾液蛋白10(cfp-10)刺激受檢者外周血中單個核細胞，通過檢測ifn-γ水平從而對結(jié)核感染進行診斷。t-spot.tb檢測不受卡介苗接種及非結(jié)核分枝桿菌感染影響，用于檢測mtb感染敏感性和特異性均高?？墒牵瑃-spot.tb雖然能對mtb感染進行快速診斷，但該方法用于區(qū)分活動性與潛伏性結(jié)核感染的敏感性及特異性達不到要求，均為70％左右。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決背景技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種用于結(jié)核感染分型的生物標志物組合、模型及其構(gòu)建方法，開發(fā)的生物標志物組合以及模型可以簡單高效的區(qū)分活動性與潛伏性結(jié)核感染，且特異性和敏感性高。

2、本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案如下：

3、一方面，本發(fā)明提供了一種用于結(jié)核感染分型的生物標志物組合，所述生物標志物組合包括：

4、(a)cd154、cd4、cd45ra、ccr7、cd39、tim-3；或

5、(b)cd154、cd4、cd45ra、ccr7、cxcr3、cxcr5、cd39、tim-3；或

6、(c)cd154、cd4、cd45ra、ccr7、cxcr3、cxcr5、cd39、tim-3、ifn-γ和tnf-α；

7、所述生物標志物組合可以用于鑒別活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核。

8、第二方面，本發(fā)明提供了上述用于結(jié)核感染分型的生物標志物組合在鑒別活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核中的應用，根據(jù)(a)～(c)任一項檢測所述的標志物的表達情況并計算獲得對應的標志物表達組的細胞百分比，根據(jù)標志物表達組的細胞百分比進行活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核的鑒別：

9、(a)檢測結(jié)核特異性細胞cd154+cd4+t細胞表面標志物cd45ra、ccr7、cd39和tim-3的表達情況，計算結(jié)核特異性cd154+cd4+t細胞中標志物表達組cd45ra+ccr7+、cd45ra-ccr7+、cd45ra-ccr7-、cd39+tim-3-、cd39+tim-3+、cd39-tim-3+的細胞百分比；或

10、(b)檢測結(jié)核特異性細胞cd154+cd4+t細胞表面標志物cd45ra、ccr7、cxcr3、cxcr5、cd39和tim-3的表達情況，計算結(jié)核特異性cd154+cd4+t細胞中標志物表達組cd45ra+ccr7+、cd45ra-ccr7+、cd45ra-ccr7-、cxcr3+cxcr5-、cxcr3-cxcr5+、cxcr3+cxcr5+、cd39+tim-3-、cd39+tim-3+、cd39-tim-3+的細胞百分比；或

11、(c)檢測結(jié)核特異性細胞cd154+cd4+t細胞表面標志物cd45ra、ccr7、cxcr3、cxcr5、cd39、tim-3和胞內(nèi)細胞因子ifn-γ、tnf-α的表達情況，計算結(jié)核特異性cd154+cd4+t細胞中標志物表達組cd45ra+ccr7+、cd45ra-ccr7+、cd45ra-ccr7-、cxcr3+cxcr5-、cxcr3-cxcr5+、cxcr3+cxcr5+、cd39+tim-3-、cd39+tim-3+、cd39-tim-3+、ifn-γ+tnf-α+、ifn-γ+tnf-α-、ifn-γ-tnf-α+的細胞百分比。

12、進一步，根據(jù)(a)～(c)任一項計算得到的標志物表達組的細胞百分比采用聚類分析將活動性結(jié)核感染者cd154+cd4+t細胞分為3型，分別記作效應型、中間型和耗竭型，潛伏性結(jié)核感染者cd154+cd4+t細胞記作記憶型；

13、以效應型、中間型、耗竭型和記憶型作為分類標簽，根據(jù)感染者聚類分析采用的cd154+cd4+t細胞中的標志物表達組的細胞百分比使用分類器構(gòu)建結(jié)核感染分型模型；

14、基于上述構(gòu)建的結(jié)核感染分型模型進行活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核的鑒別。

15、第三方面，本發(fā)明提供了一種檢測上述生物標志物組合的試劑盒，所述試劑盒包括用于流式細胞術(shù)檢測(a)～(c)任一項的標志物的帶有熒光標記的抗體。

16、進一步，所述試劑盒還包括fvs-af700，其中cd4抗體使用apc-cy7標記、cd154抗體使用bv605標記、cd45ra抗體使用bv510標記、ccr7抗體使用fitc標記、cxcr3抗體使用pecy7標記、cxcr5抗體使用bv711標記、cd39抗體使用pe標記、tim-3抗體使用bv421標記、ifn-γ抗體使用apc標記和tnf-α抗體使用percp-cy5.5標記。

17、第四方面，本發(fā)明提供了檢測上述生物標志物組合的試劑盒在鑒別活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核中的應用，使用esat-6和cfp-10對外周血單個核細胞進行誘導，將試劑盒中的帶有熒光標記的抗體和fvs-af700加入誘導后的外周血單個核細胞，然后通過多色流式細胞術(shù)檢測結(jié)核特異性cd154+cd4+t細胞中(a)～(c)任一項的標志物的表達情況。

18、第五方面，本發(fā)明提供了一種結(jié)核感染分型模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

19、s1.獲取活動性和潛伏性結(jié)核感染者的外周血單個核細胞，根據(jù)(a)～(c)任一項檢測所述的標志物的表達情況并計算獲得對應的標志物表達組的細胞百分比：

20、(a)檢測結(jié)核特異性cd154+cd4+t細胞表面標志物cd45ra、ccr7、cd39和tim-3的表達情況，在cd154+cd4+t細胞門中計算標志物表達組cd45ra+ccr7+、cd45ra-ccr7+、cd45ra-ccr7-、cd39+tim-3-、cd39+tim-3+、cd39-tim-3+、的細胞百分比；

21、(b)檢測結(jié)核特異性cd154+cd4+t細胞表面標志物cd45ra、ccr7、cxcr3、cxcr5、cd39和tim-3的表達情況，在cd154+cd4+t細胞門中計算標志物表達組cd45ra+ccr7+、cd45ra-ccr7+、cd45ra-ccr7-、cxcr3+cxcr5-、cxcr3-cxcr5+、cxcr3+cxcr5+、cd39+tim-3-、cd39+tim-3+、cd39-tim-3+的細胞百分比；

22、(c)檢測結(jié)核特異性cd154+cd4+t細胞表面標志物cd45ra、ccr7、cxcr3、cxcr5、cd39、tim-3和胞內(nèi)細胞因子ifn-γ、tnf-α的表達情況，在cd154+cd4+t細胞門中計算標志物表達組cd45ra+ccr7+、cd45ra-ccr7+、cd45ra-ccr7-、cxcr3+cxcr5-、cxcr3-cxcr5+、cxcr3+cxcr5+、cd39+tim-3-、cd39+tim-3+、cd39-tim-3+、ifn-γ+tnf-α+、ifn-γ+tnf-α-、ifn-γ-tnf-α+的細胞百分比；

23、s2.根據(jù)步驟s1獲得的cd154+cd4+t細胞門中標志物表達組的細胞百分比采用聚類分析將活動性結(jié)核感染者cd154+cd4+t細胞分為3型，分別記作效應型、中間型和耗竭型，將潛伏性結(jié)核感染者cd154+cd4+t細胞記作為記憶型；

24、s3.以效應型、中間型、耗竭型和記憶型作為分類標簽，根據(jù)步驟s1獲得的感染者的cd154+cd4+t細胞中標志物表達組的細胞百分比使用分類器構(gòu)建結(jié)核感染分型模型。

25、進一步地，所述步驟s1為：獲取活動性和潛伏性結(jié)核感染者的外周血單個核細胞，使用esat-6和cfp-10對外周血單個核細胞進行誘導，然后通過多色流式細胞術(shù)檢測(a)～(c)任一項的標志物的表達情況并計算獲得對應的標志物表達組的細胞百分比；

26、進一步，所述分類器為如隨機森林分類器、最近鄰分類器、樸素貝葉斯分類器,具體可為隨機森林分類器。

27、第六方面，本發(fā)明提供了一種結(jié)核感染分型模型，由上述結(jié)核感染分型模型的構(gòu)建方法構(gòu)建得到。

28、第七方面，本發(fā)明提供了一種結(jié)核感染分型系統(tǒng)，包括：

29、計算模塊，用于計算獲得活動性和潛伏性結(jié)核感染者cd154+cd4+t細胞中(a)～(c)任一項的標志物表達組的細胞百分比：(a)cd45ra+ccr7+、cd45ra-ccr7+、cd45ra-ccr7-、cd39+tim-3-、cd39+tim-3+、cd39-tim-3+的細胞百分比；(b)cd45ra+ccr7+、cd45ra-ccr7+、cd45ra-ccr7-、cxcr3+cxcr5-、cxcr3-cxcr5+、cxcr3+cxcr5+、cd39+tim-3-、cd39+tim-3+、cd39-tim-3+的細胞百分比；(c)cd45ra+ccr7+、cd45ra-ccr7+、cd45ra-ccr7-、cxcr3+cxcr5-、cxcr3-cxcr5+、cxcr3+cxcr5+、cd39+tim-3-、cd39+tim-3+、cd39-tim-3+、ifn-γ+tnf-α+、ifn-γ+tnf-α-、ifn-γ-tnf-α+的細胞百分比；并采用聚類分析將活動性結(jié)核感染者cd154+cd4+t細胞分為3型，分別記作效應型、中間型和耗竭型，將潛伏性結(jié)核感染者cd154+cd4+t細胞記作記憶型；

30、建模模塊，用于根據(jù)計算模塊獲得的感染者的cd154+cd4+t細胞門中標志物表達組的細胞百分比和分類標簽，使用分類器構(gòu)建結(jié)核感染分型模型，所述分類標簽為效應型、中間型、耗竭型和記憶型；

31、分型模塊，用于根據(jù)所述結(jié)核感染分型模型對待測樣本進行結(jié)核感染分型，確定待測樣本的cd154+cd4+t細胞為效應型、中間型、耗竭型或記憶型，并判斷樣本為活動性結(jié)核或者潛伏性結(jié)核。

32、本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了3種用于結(jié)核感染分型的生物標志物組合，通過對結(jié)核感染者的結(jié)核特異性cd4+cd154+t細胞的標志物進行檢測，計算其對應的標志物表達組的細胞百分比構(gòu)建結(jié)核感染分型模型。該模型構(gòu)建需要的數(shù)據(jù)獲取簡單，cd154、cd4、cd45ra、ccr7、cd39、tim-36種標志物及對應的標志物表達組用于結(jié)核感染分型區(qū)分活動性與潛伏性結(jié)核的敏感性及特異性均高于80％，而使用cd154、cd4、cd45ra、ccr7、cxcr3、cxcr5、cd39、tim-3及對應的標志物表達組、cd154、cd4、cd45ra、ccr7、cxcr3、cxcr5、cd39、tim-3、ifn-γ和tnf-α及對應的標志物表達組用于結(jié)核感染分型區(qū)分活動性與潛伏性結(jié)核的敏感性及特異性均高于90％。