本發(fā)明實施例涉及醫(yī)學(xué)檢測，具體涉及一種α-地中海貧血亞型篩查試劑盒。

背景技術(shù)：

1、人類地中海貧血是一種遺傳性血液疾病，由于一種或幾種珠蛋白基因的突變，導(dǎo)致相應(yīng)的珠蛋白肽鏈合成不足/缺乏，使形成攜帶氧氣的蛋白(血紅蛋白，hb)的肽鏈比例失衡，從而引起貧血。地中海貧血根據(jù)缺陷基因的不同，分為不同的類型，α-地中海貧血和β-地中海貧血是最常見的兩種，它們是由血紅蛋白α珠蛋白鏈或β珠蛋白鏈表達量的改變引起的。α或β珠蛋白鏈含量的改變導(dǎo)致形成血紅蛋白(hb)的肽鏈比例失衡，引起正常血紅蛋白(hb)合成減少，同時過剩的珠蛋白肽鏈在紅細胞內(nèi)聚集形成不穩(wěn)定產(chǎn)物，導(dǎo)致紅細胞破裂而引發(fā)貧血。

2、通常地中海貧血患者的表型嚴重程度與α-/β-珠蛋白鏈的比例失衡程度相關(guān)，α-/β-珠蛋白鏈的表達量越不平衡，表型越嚴重。正常人有4個α-珠蛋白基因和2個β-珠蛋白基因，當α-或β-珠蛋白基因發(fā)生缺陷時，相應(yīng)珠蛋白鏈表達下調(diào)，從而導(dǎo)致貧血。血紅蛋白h病(hb?h病)屬于中間型α-地中海貧血，是由患者的三個α-珠蛋白基因發(fā)生缺陷導(dǎo)致的，通常表現(xiàn)為輕到中度貧血，同時可出現(xiàn)疲乏無力、肝脾腫大、輕度黃疸、骨骼改變等表現(xiàn)。妊娠、感染、服用氧化性藥物等可誘發(fā)急性溶血而加重貧血。而α-珠蛋白基因三聯(lián)體的攜帶者，由于α珠蛋白基因的重復(fù)，α-珠蛋白鏈表達上調(diào)，單獨存在時不貧血，而當復(fù)合β-珠蛋白鏈的表達下調(diào)時，加重了α-/β-珠蛋白鏈的比例失衡，同樣表現(xiàn)為中間型地中海貧血。

3、中間型地中海貧血患者缺乏有效的治療手段，極大的影響患者的生存質(zhì)量。因此，早期診斷地中海貧血，實現(xiàn)對α-地中海貧血基因的分型對地中海貧血防控具有重要意義。

4、通過血液分析已經(jīng)成功開發(fā)了許多篩查地中海貧血的方法，包括血常規(guī)測定平均紅細胞血紅蛋白和平均紅細胞體積、紅細胞滲透脆性試驗、血清鐵試驗、血紅蛋白電泳測定、等電聚焦、液相色譜、質(zhì)譜(ms)等。這些檢測方法在篩查地中海貧血方面顯示出多種特點。其中，質(zhì)譜法可以測量分子的質(zhì)荷比(m/z)及其信號強度。迄今為止，各種質(zhì)譜方法已經(jīng)發(fā)展成為臨床應(yīng)用和研究的參考技術(shù)。此外，基于ms的方法也被用于診斷血紅蛋白病。由于人體血液樣本的基質(zhì)復(fù)雜，在ms篩查血紅蛋白之前，通常需要大量的樣品制備過程，如提取和分離，這是一項勞動密集型和耗時的工作。減少質(zhì)譜分析的樣品制備和分析程序在臨床應(yīng)用中是非常必要的。

5、先進的直接質(zhì)譜方法的發(fā)展和應(yīng)用已引起了廣泛的關(guān)注，以直接分析原始復(fù)雜樣品。由于樣品預(yù)處理過程少，直接電離原始樣品可方便非ms專家用于臨床應(yīng)用。敞開式電離的直接質(zhì)譜是由解吸電噴霧電離(desi)的開發(fā)和應(yīng)用首創(chuàng)的，它允許直接測定各種分析物，如未經(jīng)樣品預(yù)處理的原始生物樣品中的蛋白質(zhì)。近年來，采用不同直接電離技術(shù)的多種直接質(zhì)譜方法已被開發(fā)用于復(fù)雜樣品的直接分析，特別是在血液分析方面的臨床應(yīng)用取得了顯著進展。毫無疑問，直接質(zhì)譜法可以用于直接分析血液樣本。已經(jīng)發(fā)表了許多關(guān)于使用敞開式質(zhì)譜分析血液的優(yōu)秀文章。與desi類似，使用木質(zhì)尖端產(chǎn)生電噴霧電離的方法(wt-esi)是一種敞開式質(zhì)譜方法，其優(yōu)點是電離過程是在敞開條件下進行的。wt-esi也已成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合物等復(fù)雜的臨床和生物學(xué)分析，具有高靈敏度和高特異性。特別值得一提的是，我們之前的研究也表明健康人與地中海貧血攜帶者之間的血紅蛋白鏈在特殊電荷處存在顯著差異。然而，也有人指出，這些差異高度依賴于使用wt-esi的多個帶電蛋白離子的帶電狀態(tài)，這導(dǎo)致難以解釋ms數(shù)據(jù)。因此，獲得蛋白質(zhì)離子的簡化質(zhì)譜將有利于復(fù)雜蛋白質(zhì)的分析。

6、高分辨率、高質(zhì)量精度的基質(zhì)輔助激光解吸/電離(maldi)飛行時間質(zhì)譜(tof-ms)是一種直接質(zhì)譜方法，可以直接檢測復(fù)雜的原始蛋白質(zhì)。目前，maldi-tof-ms被廣泛應(yīng)用于臨床研究，因為maldi質(zhì)譜相對簡單，對hb等生物大分子的靈敏度和質(zhì)量測量精度高度可靠。與desi過程不同，maldi過程中蛋白質(zhì)主要以單電荷離子形式生成。maldi的這一特性為蛋白質(zhì)離子的定量比較提供了獨特的優(yōu)勢，從而提供了簡單的質(zhì)譜來顯示蛋白質(zhì)混合物。鑒于此，本發(fā)明對血液樣本進行maldi-tof-ms分析以用于地中海貧血篩查進行深入研究。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為此，本發(fā)明實施例提供一種α-地中海貧血亞型篩查試劑盒。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，血液樣本中α鏈和β鏈的信號響應(yīng)值的比率在不同類型的α-地中海貧血和健康血液樣本之間存在顯著差異，因此α/β鏈的信號響應(yīng)值比率可用于α-地中海貧血亞型的鑒定。在這項工作中，我們假設(shè)在地中海貧血和健康血液樣本中，α珠蛋基因重復(fù)的α珠蛋白基因三聯(lián)體攜帶者(r組)或α珠蛋白基因缺失的血紅蛋白h病(hb?h病)患者(d組)，在maldi過程中α鏈和β鏈會有不同的離子反應(yīng)。因此，本發(fā)明在優(yōu)化的條件下，建立maldi-tof方法來測定全血樣品中α/β鏈的比值率，以鑒定地中海貧血亞型。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明實施例提供如下技術(shù)方案：

3、根據(jù)本發(fā)明實施例的第一方面，本發(fā)明提供一種α-地中海貧血亞型篩查試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測待測樣品中α鏈與β鏈的信號響應(yīng)值的相關(guān)試劑。

4、進一步地，所述相關(guān)試劑包括基質(zhì)溶液，所述基質(zhì)溶液為濃度10mg/ml的芥子酸溶液，所述芥子酸溶液的溶劑由體積比7：3的5％甲酸水溶液和乙腈組成。

5、進一步地，所述待測樣品為血液樣品。

6、進一步地，所述試劑盒還包括正常血液樣品；

7、當待測樣品α鏈與β鏈的信號響應(yīng)值比率高于正常血液樣品α鏈與β鏈的信號響應(yīng)值比率，且二者相比具有顯著性差異時，提示存在α-珠蛋白基因的重復(fù)；

8、當待測樣品α鏈與β鏈的信號響應(yīng)值比率低于正常血液樣品α鏈與β鏈的信號響應(yīng)值比率，且二者相比具有顯著性差異時，提示存在α-珠蛋白基因的缺失。

9、進一步地，所述α鏈與β鏈的信號響應(yīng)值的檢測方法如下：

10、將待測樣品用純水稀釋200倍，與等體積的基質(zhì)溶液混合，將所得混合液裝在靶板上，在環(huán)境空氣中進行干燥，用maldi-tof進行分析。

11、進一步地，所述maldi-tof分析條件如下：ms范圍：15000-16800da；激光能量：35％；收集次數(shù)：3200次；高壓參數(shù)：加速電壓：22000v，聚焦電壓：9500v，檢測電壓：1650v，脈沖1電壓：675v，脈沖2電壓：1315v；離子篩查：1070da；控制參數(shù)：離子延遲：500ns；采樣率：2000mh。

12、根據(jù)本發(fā)明實施例的第二方面，本發(fā)明提供如上所述的試劑盒在制備α-地中海貧血亞型篩查產(chǎn)品中的應(yīng)用。

13、進一步地，所述α-地中海貧血亞型為α-珠蛋白基因三聯(lián)體攜帶者和hb?h病患者。

14、本發(fā)明實施例具有如下優(yōu)點：

15、本發(fā)明采用基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(maldi-tof-ms)直接分析原始血液樣本。本研究共采集59份全血樣本，其中健康對照28份，α-珠蛋白基因三聯(lián)體攜帶者23份，中間型地中海貧血(hb?h病)患者8份。將1微升的原始血液樣本和優(yōu)化后的有機基質(zhì)混合后直接加載到樣品板上，進行激光解吸生成原始血液樣本離子，直接觀察到高信噪比的人血紅蛋白(hb)鏈，通過α-鏈與β-鏈的信號比來鑒別地中海貧血樣本和健康對照血液樣本。結(jié)果表明，α-鏈與β-鏈的信號相應(yīng)值比率是檢測α-地中海貧血亞型的重要依據(jù)。