本發(fā)明的實施例整體涉及利用光學(xué)力和/或流體力來測量細(xì)胞對不同刺激(differential?stimuli)的響應(yīng)，以及實現(xiàn)了對生物物理和生物化學(xué)細(xì)胞監(jiān)測和定量的方法的智能算法(ia)；在某些實施例中，本發(fā)明中的方法由計算機(jī)實現(xiàn)。本發(fā)明描述的實施例包括實現(xiàn)改進(jìn)感染力試驗的增強(qiáng)性能和客觀分析，改進(jìn)感染力試驗包括中和試驗和外源因子檢測(aat)。所述方法使用基于光學(xué)力的測量值，例如激光力細(xì)胞學(xué)(lfc)。具體而言，本發(fā)明描述了自動掃描和分析多孔板的自動算法和感染度量計算，所述多孔板用于中和以及其他功能性試驗。此外，使用懸浮細(xì)胞或嵌入基質(zhì)的細(xì)胞來擴(kuò)展可用于此類試驗的感染模型以及監(jiān)測、評估和定量外源因子(aa)樣本和培養(yǎng)物的能力。

背景技術(shù)：

1、目前，血清病毒中和試驗是用于分析體內(nèi)衍生免疫力抑制病毒感染和/或復(fù)制的能力的最高標(biāo)準(zhǔn)。中和試驗用于確定血清衍生抗體在減少或阻斷在培養(yǎng)物中的細(xì)胞中的病毒感染和/或后續(xù)復(fù)制的功效?；旧希酶腥拘圆《緞┖腕w內(nèi)衍生的血清抗體的組合對人類或動物細(xì)胞進(jìn)行體外處理，以檢查血清衍生抗體是否對體外細(xì)胞內(nèi)的病毒劑的感染和/或復(fù)制具有特異性和有效性。這些類型的分析實驗需要附加分析。蝕斑試驗和蝕斑減少中和試驗(prnt)都測量每單位體積樣本中感染性病毒顆粒的數(shù)量，后者還測量因中和血清或其他藥劑引起的感染力單位的減少。該試驗涉及將含有病毒的溶液置于平板中生長的附著細(xì)胞上，涂抹涂層(通常為瓊脂糖)以防止病毒自由傳播，然后等待3至15天，以使死亡或清除的細(xì)胞(蝕斑)的區(qū)域由于單一感染性病毒顆粒而形成。類似地，組織培養(yǎng)物感染量50(tcid50)是通過執(zhí)行終點稀釋試驗而得到的特定體積中的感染性病毒濃度的量度。tcid50被定義為感染培養(yǎng)物中細(xì)胞的給定批次接種孔的50％所需的病毒稀釋度。盡管這些方法已經(jīng)使用了數(shù)十年，但在實驗和操作員之間以可靠和可再現(xiàn)的結(jié)果執(zhí)行上述方法方面仍面臨著固有挑戰(zhàn)。在分析懸浮液中的細(xì)胞、對大量樣本的要求(用于稀釋度計算)、分析的耗時和主觀技術(shù)以及細(xì)胞操作導(dǎo)致的細(xì)胞死亡和/或感染參數(shù)更改等不良后果方面，這些試驗也存在局限性。需要大量稀釋度的一個原因是當(dāng)前方法的有限動態(tài)范圍和高可變性。

2、現(xiàn)有技術(shù)描述了使用光學(xué)密度和各種約束來確定中和效價，例如分析和繪制每個樣本的最大光學(xué)密度，的方法和裝置，(公開號為第2013/0084560的美國專利，該專利借引用并入本發(fā)明)。但公開號為第2013/0084560的美國專利僅使用了光學(xué)密度，沒有使用微流體和/或光學(xué)力，也不包括使用通過自動實時網(wǎng)格搜索算法實現(xiàn)的附加智能，該算法計算哪些樣本需要被讀取/分析以確定實驗的結(jié)果。美國專利第4,329,424號描述了另一個半自動系統(tǒng)，但這種方法使用光源，而不是光學(xué)力，而且不是全自動的。

3、此外，盡管美國專利第8,778,347號描述了使用由流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測的滅活熒光標(biāo)記病毒，以減少實驗操作所需的安全預(yù)防措施，而歐洲專利第1140974號描述了使用假病毒報告基因，但是這兩個參考文獻(xiàn)都具有局限性，這是因為由于試驗中使用的樣本細(xì)胞或感染原的標(biāo)記或修飾繁瑣，必須要分析大量樣本。由于細(xì)胞和感染物的修飾已被證明能夠活化、分化或更改感染力和/或功能，因此需要的是無標(biāo)記分析，以充當(dāng)需要這種修飾來分析的傳統(tǒng)方法的理想替代。

4、另外，盡管wo1989006705描述了使用蝕斑轉(zhuǎn)移試驗來檢測逆轉(zhuǎn)錄酶病毒和測量中和抗體，但其中的啟示將實驗者局限于使用單層細(xì)胞類型。實際上，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并非所有病毒都會感染形成單層的細(xì)胞。需要的是能夠使用懸浮細(xì)胞或嵌入基質(zhì)的細(xì)胞進(jìn)行感染研究和分析的方法和設(shè)備，從而在病毒感染的實驗中能夠用更多種細(xì)胞類型。

5、現(xiàn)有技術(shù)(例如美國專利第6,778,263號)描述了校準(zhǔn)物(例如，微珠或細(xì)胞)的使用，但這種啟示因為僅描述了在時間延遲積分(tdi)檢測器的情況下使用校準(zhǔn)物，所以具有局限性。tdi檢測器的功能性依賴于使固態(tài)檢測器(如電荷耦合器件陣列)中光子感生電荷線與試樣流動同步地位移，并使用校準(zhǔn)物來提高系統(tǒng)的性能。另外，現(xiàn)有技術(shù)的校準(zhǔn)微珠僅限于校準(zhǔn)流量和對準(zhǔn)tdi檢測器，不用于校準(zhǔn)分析信息，所述分析信息用于例如折射率(例如微珠/人工細(xì)胞的折射率比)的物理或化學(xué)信息的數(shù)據(jù)校正、歸一化、定量或計算。缺乏的是校準(zhǔn)物的啟示或使用，所述校準(zhǔn)物描述如光學(xué)力、光學(xué)扭矩、光動力學(xué)、有效折射率、尺寸、形狀的測量值或相關(guān)測量值，其中校準(zhǔn)物是基于聚合物、玻璃、生物制劑、脂質(zhì)、囊泡或細(xì)胞(活的或固定的)的校準(zhǔn)物。另外，還缺少對具有與所關(guān)注粒子相關(guān)的特性但不干擾所關(guān)注樣本的數(shù)據(jù)收集的校準(zhǔn)物的啟示。

6、需要改進(jìn)方法和設(shè)備以在多個識別方面(如生物物理和生物化學(xué)曲線)有效表征生物成分和系統(tǒng)。某些實施例中，此類方法和設(shè)備包括的智能算法和方法應(yīng)適用于例如衍生自基于病毒的接種疫苗或藥物發(fā)現(xiàn)試驗的樣本，使得能夠在完整或耗盡的細(xì)胞分離株中檢驗細(xì)胞類型之間、個體群組之間或甚至試驗之間的感染力參數(shù)偏差。其他樣本處理可能包括血清抗體、抗病毒化合物、抗菌化合物、毒素、有毒的工業(yè)物質(zhì)或化學(xué)品(tims/tics)、寄生蟲以及基因或細(xì)胞療法產(chǎn)物(如car?t細(xì)胞和溶瘤疫苗)的評估。還需要針對細(xì)菌的中和試驗，該試驗利用被設(shè)計成對細(xì)菌敏感的細(xì)胞(低反應(yīng)閾值)，該細(xì)胞包括用于借助基于多層面光學(xué)力的測量值來測量感染原的感染性的細(xì)胞系或初生細(xì)胞。理想情況下，此類方法和設(shè)備應(yīng)能夠通過分析生物制造液體(如條件培養(yǎng)基)或其他所關(guān)注樣本(如從生物反應(yīng)器或其他此類容器獲得的樣本)來確定感染力測量值，而該感染力測量值有助于外源因子檢測。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、目前用于表征生物細(xì)胞和系統(tǒng)的可用程序和分析方法，如感染力試驗(例如中和試驗、tcid50和臨床樣品操作)需要大量稀釋度、潛在有害的標(biāo)記程序，并產(chǎn)生高度多變的結(jié)果，使得實驗之間和實驗中以及試驗的比較有挑戰(zhàn)性，下游的細(xì)胞應(yīng)用受限。本發(fā)明克服了這些限制，提供了與生物物理和生物化學(xué)細(xì)胞監(jiān)測和定量相關(guān)的新方法，包括使用基于光學(xué)力的技術(shù)(例如激光力細(xì)胞學(xué)(lfc))來實現(xiàn)未標(biāo)記細(xì)胞樣本的增強(qiáng)自動掃描的智能分析算法，其結(jié)果是對樣本稀釋度及最終樣本試樣的需求減少，以及分析所需的時間及相關(guān)成本減少，同時在分析過程中實現(xiàn)規(guī)范一致的細(xì)胞評價。此外，本發(fā)明實現(xiàn)了使用懸浮細(xì)胞或嵌入基質(zhì)的細(xì)胞以用于分析，擴(kuò)展用于中和或其他功能性試驗的感染模型的動態(tài)范圍，以及監(jiān)測、評估和定量來自樣本和培養(yǎng)物的外源因子的能力。此外，本發(fā)明描述的發(fā)明方法可由計算機(jī)實施，從而提高效率、可靠性和再現(xiàn)性。

2、背景技術(shù)激光力細(xì)胞學(xué)(lfc)的基本前提是，其利用微流體和光誘導(dǎo)壓力的結(jié)合，對每個細(xì)胞進(jìn)行光學(xué)測量，包括光學(xué)力或壓力、尺寸、速度和其他參數(shù)。雖然lfc是一個優(yōu)選實施例，但是根據(jù)本發(fā)明可以使用其他基于光學(xué)力的技術(shù)。將lfc應(yīng)用于中和、tcid50以及其他試驗的掃描和分析中以用于確定病毒效價和感染力(兩者為同義詞)以及確定濃度是通過測量細(xì)胞特征中的變化來進(jìn)行的，這些變化指示的是與含有抗體和/或所關(guān)注的病毒的血清共同培養(yǎng)的細(xì)胞相對于僅用非免疫血清處理的細(xì)胞(對照或安慰劑)的細(xì)胞病變效應(yīng)。此外，在無血清的情況下與病毒共培養(yǎng)的細(xì)胞可用于確定衍生自原代或細(xì)胞培養(yǎng)源的細(xì)胞感染率。在下文中，任何時候提到中和試驗，應(yīng)認(rèn)為也提到了作為常規(guī)應(yīng)用的tcid50或蝕斑試驗。

3、本發(fā)明減少了與實驗主觀性、時間和成本要求相關(guān)的挑戰(zhàn)，同時增強(qiáng)了關(guān)于讀取和分析樣本的客觀易用性。在某些實施例中，這是通過使用智能算法(ia)掃描并自動和在算法上計算稀釋度和/或效價確定和要求而實現(xiàn)的，這獨立于人工計算，由計算機(jī)實施的過程實現(xiàn)。一種智能算法為涉及包括模糊邏輯方法的復(fù)雜的指令集，這些方法包含諸如感染力和感染度量(例如，低、中或高感染力范圍)等可變結(jié)果。ia還可以包括人工智能(ai)概念，人工智能概念包括神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(nn)(反向傳播或概率神經(jīng)網(wǎng)絡(luò))或機(jī)器學(xué)習(xí)，以將校準(zhǔn)數(shù)據(jù)應(yīng)用于當(dāng)前樣本，為取樣更好地預(yù)測最佳網(wǎng)格搜索模式。本文公開的這種新方法最終減少了每次實驗所需的稀釋度的量，從而節(jié)省了實驗人員資源、時間和訓(xùn)練有素的人員對結(jié)果進(jìn)行分析的需要，并且消除了目前定量中和試驗效價所需要的報告基因、抗體或其他染色/標(biāo)記機(jī)制的使用。

4、本發(fā)明利用光學(xué)力和/或流體力優(yōu)化了對不同刺激的細(xì)胞響應(yīng)的測量，并能夠提供一致可靠的生物系統(tǒng)表征。