本發(fā)明涉及一種熒光微球檢測卡，具體涉及一種基于ha1蛋白單克隆抗體的熒光微球檢測卡，屬于生物檢測。

背景技術(shù)：

1、禽流感是由a型流感病毒引起的，能夠在鳥類和哺乳動物中傳播，甚至跨越物種障礙感染人類。禽流感病毒對公共衛(wèi)生和養(yǎng)禽業(yè)構(gòu)成了嚴重威脅。因此，及時、準確地檢測禽流感病毒對于疾病的防控具有重要意義。目前，禽流感病毒常用檢測方法如下：

2、(1)血凝試驗與血凝抑制試驗

3、血凝試驗(hemagglutination，ha)與血凝抑制試驗(hemagglutinationinhibition，hi)是一套成本效益高、快速且廣泛應(yīng)用的流感病毒檢測技術(shù)，能夠有效辨識和分型流感病毒。該方法用于驗證病毒分離后采集的尿囊液是否具有血凝活性，然后用抗病毒血清對需要血凝活性鑒定的分離株進行血凝抑制試驗。wiriyarat等人表明ha與hi方法在豚鼠和鵝紅細胞中的應(yīng)用可表現(xiàn)出高敏感性和特異性。在檢測aiv抗體時，因其高度敏感和特異的特點而被譽為診斷的“黃金標(biāo)準”。

4、值得注意的是，盡管ha和hi試驗為流感病毒的檢測與鑒定提供了快速、經(jīng)濟的方法，但在實際應(yīng)用中，血清中存在的非特異性抑制因子可能會與病毒的受體結(jié)合部位競爭，從而導(dǎo)致實驗結(jié)果出現(xiàn)假陽性或者抗體滴度估計的不準確，這對實驗結(jié)果的準確性和可靠性構(gòu)成了挑戰(zhàn)。因此，為了提高診斷的準確度，需要進一步優(yōu)化試驗條件或結(jié)合使用其他補充性的檢測方法，以確保流感病毒檢測與鑒定的科學(xué)性和有效性。

5、(2)酶聯(lián)免疫吸附試驗

6、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked?immunosorbent?assay，elisa)是一種常用的生物化學(xué)分析技術(shù)，用于檢測樣本中特定抗原或抗體的存在。迄今為止，已開發(fā)多種elisa試劑盒用于檢測在家禽以及其他包括人類在內(nèi)的物種中的aiv抗體。這些試驗主要采用間接elisa技術(shù)，需利用特異性的抗免疫球蛋白偶聯(lián)劑，并依賴于濃縮及純化的活病毒作為檢測用的抗原。a.l.shafer等研究者所開發(fā)的基于重組桿狀病毒的競爭性elisa技術(shù)，用于多種鳥類中aiv的血清學(xué)診斷，避免了使用多種抗免疫球蛋白偶聯(lián)物或活病毒，減少了暴露于活病毒的感染風(fēng)險。此外，elisa還能夠識別出aiv不同亞型間的交叉反應(yīng)。zhang等人研發(fā)的雙抗體夾心elisa適用于檢測aiv的np蛋白，通過采用單克隆抗體作為捕獲抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔源多克隆免疫球蛋白g作為檢測抗體，能檢測h1至h15所有亞型的aiv，且不與其他禽病原體產(chǎn)生交叉反應(yīng)。ho等人開發(fā)的基于h5血凝素特異性單克隆抗體和n1神經(jīng)氨酸酶線性表位的抗原捕獲elisa，能同時檢測h5和n1亞型抗原，適用于h5n1亞型aiv的快速檢測。通過多種elisa技術(shù)的發(fā)展，包括競爭性elisa和夾心elisa等，為禽流感病毒抗體的檢測提供了高敏感性、高特異性的方法，但elisa檢測方法依舊存在用時較長的問題。

7、(3)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和實時熒光定量聚合鏈式反應(yīng)

8、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse?transcription-polymerase?chain?reaction，rt-pcr)是rna病毒檢測的標(biāo)準方法，特別適用于流感和其他常見呼吸道病毒。該技術(shù)通過逆轉(zhuǎn)錄酶將病毒rna轉(zhuǎn)換為cdna，隨后進行pcr擴增，以檢測樣本中的病毒rna。該過程涉及使用針對病毒基因組保守區(qū)域特異性的引物和探針。盡管rt-pcr因其高靈敏度和特異性而在流感檢測中得到驗證，但其依賴于專用實驗室設(shè)備和試劑，如熱循環(huán)儀和生物安全柜，導(dǎo)致成本較高，可能不適用于獨立醫(yī)療實踐。實時熒光定量聚合鏈式反應(yīng)(real-timefluorescence?quantitative?polymerisation?chain?reaction，rt-qpcr)作為rt-pcr技術(shù)的進階版，在實時監(jiān)控擴增過程的同時，通過測定循環(huán)閾值(ct)提供定量診斷信息，成為診斷實驗室中日益受歡迎的技術(shù)。世界衛(wèi)生組織和美國疾病控制與預(yù)防中心為rt-qpcr檢測提供指南，指出ct值低于40個循環(huán)時視為陽性。rt-pcr與rt-qpcr在診斷和治療實用性方面未有官方確認的差異，并且兩者因其高度的應(yīng)用價值繼續(xù)在病毒診斷中占據(jù)重要地位，選擇則取決于實驗室的設(shè)備能力，限制了其更廣泛的應(yīng)用。

9、(4)重組酶聚合酶擴增

10、重組酶聚合酶擴增(recombinase?polymerase?amplification，rpa)由piepenburg等人于2006年提出，利用特異性引物和探針快速放大目標(biāo)核酸，yehia等人建立了靈敏度為100％的h5?rt-rpa檢測方法對h5n1亞型的aiv進行檢測，實現(xiàn)了5至7min內(nèi)完成檢測且靈敏度達100％，優(yōu)于實時rt-pcr的60至90min。wang等的研究通過結(jié)合exo探針，擴展了rt-rpa在aiv不同h5亞型檢測上的應(yīng)用，證明了rpa技術(shù)在低溫下無需特殊設(shè)備即可進行，特別適合現(xiàn)場快速檢測。rpa的主要優(yōu)勢包括操作簡易、反應(yīng)速度快、結(jié)果直觀，降低對儀器和操作人員的依賴性。然而，rpa在廣泛應(yīng)用過程中遇到的主要挑戰(zhàn)是引物設(shè)計的復(fù)雜性，盡管存在指導(dǎo)性方法，但缺乏自動化設(shè)計規(guī)則，導(dǎo)致需通過實驗篩選最佳引物，限制了其更廣泛的應(yīng)用。

11、(5)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增

12、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated?isothermal?amplification，lamp)是一種相對較新的分子生物學(xué)技術(shù)，是由notomi等人于2000年開發(fā)的技術(shù)，是一種在大約65℃的恒溫條件下迅速完成核酸擴增的方法，無需模板熱變性或長時間的溫度循環(huán)，且不依賴昂貴試劑，僅需水浴設(shè)備即可實施。該技術(shù)通過生成大量焦磷酸鎂沉淀，可利用濁度測量進行檢測，因而極適合現(xiàn)場快速應(yīng)用。imai等人通過特定內(nèi)外引物的設(shè)計，實現(xiàn)了與傳統(tǒng)rt-pcr相比靈敏度提高約100倍的快速且靈敏的檢測方案。jayawardena等人進一步簡化rt-lamp流程，開發(fā)出無需rna提取即可檢測病毒培養(yǎng)物中h5亞型aiv的方法，雖靈敏度相對較低。dinh等人通過新設(shè)計引物，針對aiv開發(fā)了特異性和敏感性更高的改進rt-lamp方法。jung等人通過結(jié)合rt-lamp與免疫層析試紙條，針對ha基因設(shè)計引物，實現(xiàn)了對h1、h3、h5等多個aiv亞型的同時檢測，適用于現(xiàn)場早期診斷。zhang等人基于aiv的m基因、h5基因和h9基因設(shè)計引物，實現(xiàn)了rt-lamp技術(shù)篩選aiv及區(qū)分h5和h9亞型，展現(xiàn)了超過rt-pcr的高檢測靈敏度和更短的檢測時間。rt-lamp技術(shù)以其操作簡便、快速及成本效益高等特點，成為具有廣泛應(yīng)用潛力的診斷工具，尤其適合現(xiàn)場快速檢測。然而，該技術(shù)面臨的主要挑戰(zhàn)在于高特異性引物的設(shè)計，這一點對其靶向性和應(yīng)用范圍產(chǎn)生重要影響。

13、(6)膠體金免疫層析技術(shù)

14、膠體金免疫層析技術(shù)(gold?immunochromatographic?assay，gica)通過利用硝酸纖維素膜作為固相載體，并通過固定抗原或抗體引入待測樣本以實現(xiàn)快速可視化檢測，已經(jīng)成為一種重要的分析方法。金納米粒子，由于其微小尺寸、獨特的化學(xué)特性、易于修改的表面以及高純度等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于多種檢測場景，特別是在癌癥檢測領(lǐng)域，預(yù)示了gica技術(shù)未來發(fā)展的廣闊前景。li等人通過建立一種膠體金免疫層析技術(shù)用于快速半定量檢測aiv，設(shè)計了四個不同濃度的檢測線，以此反映不同器官的病毒感染程度，體現(xiàn)了gica在實際應(yīng)用中的靈活性和有效性。gica因具備簡便、高準確性、快速反應(yīng)、低成本及環(huán)境友好等特性，在廣泛領(lǐng)域內(nèi)得到應(yīng)用。盡管gica技術(shù)具有顯著的實用價值，但對其深入研究和改進，特別是在提高其科學(xué)評估的能力方面，仍然具有重要意義。

15、綜上所述，傳統(tǒng)方法中的存在操作復(fù)雜、靈敏度低、耗時長等問題。因此，開發(fā)一款方法操作簡便、結(jié)果快速，靈敏度和特異性高，檢測結(jié)果可靠的快速檢測h9n2亞型禽流感檢測試劑卡顯得尤為必要。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種方法操作簡便、結(jié)果快速，靈敏度和特異性高，檢測結(jié)果可靠的快速檢測h9n2亞型禽流感檢測試劑卡。

2、為此，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的：

3、一種基于ha1蛋白單克隆抗體的熒光微球檢測卡，包括樣本墊、結(jié)合墊、nc膜、吸水墊及pcv底板；所述樣本墊、結(jié)合墊、nc膜和吸水墊按樣品層析方向依次設(shè)置于pcv底板上；所述nc膜上設(shè)有檢測t線和質(zhì)控c線，所述檢測線靠近所述結(jié)合墊，所述質(zhì)控線靠近吸水墊，所述結(jié)合墊上負載有熒光微球標(biāo)記的ha1蛋白單克隆抗體1a3；

4、所述的檢測t線上包被有熒光微球標(biāo)記的ha1蛋白單克隆抗體2e9，所述質(zhì)控線包被有熒光微球標(biāo)記的羊抗鼠igg抗體。

5、進一步的，上述的一種基于ha1蛋白單克隆抗體的熒光微球檢測卡，所述的熒光微球標(biāo)記的ha1蛋白單克隆抗體1a3通過下述方法制備的：

6、(1)將熒光微球進行活化；

7、(2)將活化后的熒光微球與ha1蛋白單克隆抗體1a3抗體偶聯(lián)

8、(3)偶聯(lián)后進行封閉并且清洗未結(jié)合的抗體。

9、進一步的，上述的一種基于ha1蛋白單克隆抗體的熒光微球檢測卡，所述的熒光微球標(biāo)記的ha1蛋白單克隆抗體2e9通過下述方法制備的：

10、(1)將熒光微球進行活化；

11、(2)將活化后的熒光微球與ha1蛋白單克隆抗體2e9抗體偶聯(lián)；

12、(3)偶聯(lián)后進行封閉并且清洗未結(jié)合的抗體。

13、進一步的，上述的一種基于ha1蛋白單克隆抗體的熒光微球檢測卡，所述的ha1蛋白單克隆抗體1a3通過下述方法制備的：

14、(1)將pet28a-ha1重組蛋白與佐劑1:1混合后免疫balb/c小鼠；

15、(2)通過細胞融合技術(shù)，將免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，篩選陽性克隆細胞株，記為陽性克隆細胞株1a3；

16、(3)將篩選出的陽性克隆細胞株1a3進行單細胞克隆化并擴增培養(yǎng)，得到ha1蛋白單克隆抗體1a3；

17、(4)通過protein?g親和層析柱純化步驟(3)制備的ha1蛋白單克隆抗體1a3；

18、(5)采用間接elisa、western?blot和間接免疫熒光方法對純化后的ha1蛋白單克隆抗體1a3的純度、特異性和親和力進行鑒定。

19、進一步的，上述的一種基于ha1蛋白單克隆抗體的熒光微球檢測卡，所述的ha1蛋白單克隆抗體2e9通過下述方法制備的：

20、(1)將pet28a-ha1重組蛋白與佐劑1:1混合后免疫balb/c小鼠；

21、(2)通過細胞融合技術(shù)，將免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，篩選陽性克隆細胞株，記為陽性克隆細胞株2e9；

22、(3)將篩選出的陽性克隆細胞株2e9進行單細胞克隆化并擴增培養(yǎng)，得到ha1蛋白單克隆抗體2e9；

23、(4)通過protein?g親和層析柱純化步驟(3)制備的ha1蛋白單克隆抗體2e9；

24、(5)采用間接elisa、western?blot和間接免疫熒光方法對純化后的ha1蛋白單克隆抗體2e9的純度、特異性和親和力進行鑒定。

25、進一步的，上述的一種基于ha1蛋白單克隆抗體的熒光微球檢測卡，所述的重組載體pet28a-ha1由載體pet28a和ml14-ha1基因組成。

26、進一步的，上述的一種基于ha1蛋白單克隆抗體的熒光微球檢測卡，所述的pet28a-ha1通過下述方法制備的：

27、一)病毒rna提取及反轉(zhuǎn)錄

28、取h9n2亞型禽流感毒株尿囊液250μl，使用trizol提取全病毒基因組rna，隨后以提取的病毒rna為模板，使用beyorttmii?cdna第一鏈合成試劑盒進行擴增全病毒基因組rna得到反轉(zhuǎn)錄cdna，儲存?zhèn)溆?；所述的擴增全病毒基因組rna的反應(yīng)組分和體系如下：

29、二)pet28a-ha1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

30、(1)pcr擴增

31、以反轉(zhuǎn)錄所得的cdna為模板，采用核苷酸序列如seq?id?no：1的所示上游引物ml14-ha1-f，核苷酸序列如seq?id?no：2所示的下游引物ml14-ha1-r，進行pcr擴增；將擴增產(chǎn)物加入dna上樣緩沖液混勻后進行瓊脂糖凝膠電泳，將正確大小的目的條帶進行切除，通過瓊脂糖凝膠純化試劑盒進行pcr產(chǎn)物回收；

32、(2)限制性內(nèi)切酶酶切

33、將回收后的ml14-ha1基因的pcr產(chǎn)物與pet28a空載體進行雙酶切反應(yīng)；

34、(3)目的基因與載體的連接

35、將酶切后的ml14-ha1基因膠回收產(chǎn)物與酶切后的pet28a載體膠回收產(chǎn)物連接得到連接產(chǎn)物pet28a-ha1；

36、(4)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和篩選

37、將連接產(chǎn)物pet28a-ha1進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，取鑒定為陽性的菌液進行測序，將序列比對正確的菌液擴增至5ml含有卡那的lb液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)12～16h后，對培養(yǎng)后的菌液進行pcr鑒定，選取pcr鑒定為陽性的菌液；

38、(5)質(zhì)粒的提取并且鑒定

39、對步驟(4)陽性的菌液進行提取重組質(zhì)粒，并且對提取的提取重組質(zhì)粒進行鑒定，得到pet28a-ha1重組質(zhì)粒。

40、三)pet28a-ha1重組質(zhì)粒進行原核表達及純化。

41、進一步的，上述的一種基于ha1蛋白單克隆抗體的熒光微球檢測卡，所述的重組質(zhì)粒的鑒定是利用bamh?i和xho?i兩種限制性內(nèi)切酶進行酶切，然后置于37℃水浴鍋反應(yīng)1～2h經(jīng)凝膠回收后，ml14-ha1基因與線性化的載體pet28a進行連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到dh5α感受態(tài)細胞中，涂板并挑取單克隆陽性菌，對挑取單克隆陽性菌進行菌液pcr鑒定，得到pet28a-ha1重組質(zhì)粒。

42、進一步的，上述的一種基于ha1蛋白單克隆抗體的熒光微球檢測卡，所述的pet28a-ha1重組質(zhì)粒進行原核表達及純化的方法如下：

43、(1)原核表達

44、將pet28a-ha1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至transetta感受態(tài)細胞中，挑取單菌落進行誘導(dǎo)表達，分別在37℃誘導(dǎo)表達5h，16℃誘導(dǎo)表達12h，經(jīng)sds-page電泳檢測；

45、(2)蛋白純化

46、用ni-nta瓊脂糖凝膠純化菌體蛋白，得到目的蛋白，通過sds-page電泳鑒定純化的蛋白，并將其進行透析，獲得濃度為0.98mg/ml的目的蛋白，即為pet28a-ha1純化重組蛋白；

47、(3)重組蛋白的鑒定

48、將步驟(3)的pet28a-ha1純化重組蛋白作為抗原，利用鼠源his-tag?1:1000稀釋后作為一抗，羊抗鼠hrp-lgg以1:2000比例稀釋后作為二抗，進行western?blot驗證。

49、進一步的，上述的一種基于ha1蛋白單克隆抗體的熒光微球檢測卡，所述的pet28a氨基酸序列如seq?id?no：3所示；所述的ml14-ha1氨基酸序列如seq?id?no：4所示。

50、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供方的技術(shù)方案具有如下技術(shù)優(yōu)點：

51、(1)快速性：本技術(shù)通過熒光微球免疫層析檢測卡，可以在短時間內(nèi)完成檢測，快速獲得結(jié)果，有助于及早診斷和控制禽流感的傳播。

52、(2)高靈敏度和特異性：熒光微球免疫層析檢測卡基于h9n2亞型禽流感ha1蛋白單克隆抗體，具有較高的靈敏度和特異性，可以更準確地檢測出病毒存在，避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

53、(3)操作簡便：相比于其他復(fù)雜的檢測方法，如pcr技術(shù)，本技術(shù)無需復(fù)雜的儀器和操作步驟，操作簡便，適用于各種環(huán)境下的使用。

54、(4)成本效益：熒光微球免疫層析檢測卡制備成本低，且一次性使用，減少了交叉污染的可能性，具有較高的成本效益。

55、(5)適用性廣泛：本技術(shù)可以在不同場所和條件下進行使用，如養(yǎng)殖場、實驗室、醫(yī)療機構(gòu)等，具有較強的適用性和推廣價值。

56、通過上述優(yōu)勢，本技術(shù)有望解決傳統(tǒng)方法中的復(fù)雜性、低靈敏度、耗時長等問題，為h9n2亞型禽流感的早期診斷和有效控制提供了一種新的有效手段。