本發(fā)明涉及一種開關(guān)型電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器和這種傳感器的制備方法以及使用方法，屬于電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器。

背景技術(shù)：

1、真菌毒素污染是一個全球性問題，對食品和飼料安全構(gòu)成重大威脅。在各種類型的真菌毒素中，赭曲霉毒素a（ota）是一種具有代表性的毒素，儲量豐富，污染食物，并與嚴(yán)重的健康問題有關(guān)，如腎毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性、致畸性、致癌性和人體免疫毒性。歐盟已經(jīng)確定了谷物（5?g/kg）、葡萄酒（2?g/kg）和咖啡制品（5?mg/kg）中的最大濃度。開發(fā)一種快速靈敏的檢測技術(shù)以實現(xiàn)準(zhǔn)確的ota檢測至關(guān)重要。

2、赭曲霉毒素a的檢測方法：目前赭曲霉毒素a的檢測方法主要有氣相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附試驗、色譜法、毛細(xì)管電泳、比色法、熒光分析和表面增強(qiáng)拉曼光譜等。雖然這些方法提供了定量和定性結(jié)果，但它們耗時，需要昂貴的設(shè)備，涉及復(fù)雜的樣品制備步驟，并且需要訓(xùn)練有素的人員。因此，一種可靠、靈敏的赭曲霉毒素a檢測方法對于保證食品安全及人類生命安全至關(guān)重要。

3、電化學(xué)發(fā)光（ecl）技術(shù)作為在化學(xué)發(fā)光的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種強(qiáng)有力的分析方法，無需引入外部光源，在光電倍增管等光學(xué)儀器的輔助下采集發(fā)光強(qiáng)度圖譜，并建立其與待測物關(guān)系從而實現(xiàn)微量分析，結(jié)合了電化學(xué)技術(shù)的高可控性和化學(xué)發(fā)光技術(shù)的高靈敏性，具有可控性強(qiáng)、背景信號較低、選擇性好、響應(yīng)時間短、操作簡單等優(yōu)勢；核酸適配體是由指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化（selex）篩選得出一種新型識別元件，具有與抗體相當(dāng)?shù)母哂H和力、高靈敏度，其合成簡單快速、成本低、選擇性好、穩(wěn)定性高且易于修飾標(biāo)記，能夠與靶標(biāo)物質(zhì)快速、高親和力和高特異性結(jié)合，將適配體末端交聯(lián)到固相載體作為捕獲分子，去捕獲待測標(biāo)本中的靶標(biāo)物質(zhì)，所以適配體檢測真菌毒素也隨之發(fā)展起來。

4、發(fā)光體的選擇在構(gòu)建ecl適配體傳感器中至關(guān)重要。在各種ecl發(fā)光體中，基于聯(lián)吡啶釕（ru(bpy)32+）的ecl系統(tǒng)具有較高的發(fā)光效率和化學(xué)穩(wěn)定性，使其成為復(fù)雜環(huán)境中傳感應(yīng)用的理想選擇。由于量子點（qds）具有高發(fā)光品質(zhì)、強(qiáng)生物相容性、良好的穩(wěn)定性和低毒性，隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，量子點已經(jīng)成為ecl研究領(lǐng)域的熱門話題?；陂_關(guān)型的結(jié)構(gòu)設(shè)計也提高了生物傳感器的穩(wěn)定性和敏感性，因為其在不同狀態(tài)之間顯著的信號差異。在開關(guān)系統(tǒng)中，獲得高ecl強(qiáng)度的“開”信號和低ecl強(qiáng)度的“關(guān)”信號是實現(xiàn)高靈敏度的關(guān)鍵，這也是開關(guān)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)設(shè)計中的兩個關(guān)鍵點。

5、?發(fā)明的目的在于提供一種能克服上述問題以及制備簡單、操作靈活、靈敏度高、準(zhǔn)確性高、選擇性及穩(wěn)定性好的開關(guān)型電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器，將硫化鎘量子點（cdsqds）與適配體通過共價鍵結(jié)合，并通過適配體與其互補(bǔ)鏈的有效連接成功地與傳感器相連。通過硫化鎘量子點與聯(lián)吡啶釕的有效連接，縮短電化學(xué)反應(yīng)過程中的電子轉(zhuǎn)移距離，從而提高適配體傳感器

6、的ecl強(qiáng)度。構(gòu)建的傳感器無需酶的催化作用，直接通過適配體與靶標(biāo)物質(zhì)特異性結(jié)合，可對谷物中赭曲霉毒素a特定檢測的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器的制備方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、技術(shù)方案為：一種檢測赭曲霉毒素a的適配體傳感器的制備方法，其特征在于：適配體傳感器的敏感界面為碳化鈦（ti3c2tx）mxene材料，通過共反應(yīng)鍵使得修飾有硫化鎘量子點的適配體能夠牢固地固定在電極表面，以實現(xiàn)cds?qds與ru(bpy)32+的有效連接。當(dāng)引入ota后，使cds-apt從傳感器接口釋放，從而降低適配體傳感器的ecl強(qiáng)度，使傳感器處于“關(guān)”狀態(tài)。通過傳感器“開”狀態(tài)的高ecl強(qiáng)度，與“關(guān)”狀態(tài)的低ecl強(qiáng)度形成鮮明對比，可以顯著增強(qiáng)傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性。

2、?所述的一種檢測赭曲霉毒素a的適配體傳感器的制備方法，其特征在于：玻碳電極（d=3mm）的清洗，適配體傳感器敏感界面（ti3c2tx?mxene）的表征，cds?qds的合成，適配體傳感器工作曲線的建立，適配器傳感器性能的檢測，傳感器對實際樣品的檢測。

3、?所述的一種檢測測赭曲霉毒素a的適配體傳感器的制備方法，其特征在于：實驗條件的優(yōu)化，主要包括測試底液的ph、適配體濃度、適配體與互補(bǔ)鏈的雜交時間以及適配體與靶標(biāo)物質(zhì)的孵育時間；所制備的適配體傳感器的工作曲線為：y?=?11123.73??4035.98lgx?（ r2=0.994）；適配體傳感器性能檢測包括特異選擇性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性以及適配體傳感器對谷物樣品回收率的測定。

4、目標(biāo)物質(zhì)電化學(xué)發(fā)光檢測：采用電化學(xué)發(fā)光檢測法利用三電極體系在最佳實驗條件下檢測谷物樣品，根據(jù)檢測結(jié)果中電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值進(jìn)行分析即可獲知電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度峰值大小與該赭曲霉毒素a的濃度成反比，據(jù)此可獲得赭曲霉毒素a的濃度信息。

5、?本發(fā)明的制備原理為：本發(fā)明采用碳化鈦（ti3c2tx）mxene作為基底納米材料，將cds?qds作為ecl試劑ru(bpy)32+的共反應(yīng)物應(yīng)用到ecl實驗中，通過cds?qds與ru(bpy)32+的有效連接縮短了電子轉(zhuǎn)移距離，從而提高了ecl強(qiáng)度，實現(xiàn)第一次“開”狀態(tài)。當(dāng)引入ota后，使得cds?qds與ru(bpy)32+失去有效連接，使傳感器處于“關(guān)”狀態(tài)。通過傳感器“開”狀態(tài)的高ecl強(qiáng)度，與“關(guān)”狀態(tài)的低ecl強(qiáng)度形成鮮明對比，增強(qiáng)了傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性。通過經(jīng)上述步驟制備的適配體傳感器，簡單靈敏，穩(wěn)定性和特異性較好，重現(xiàn)性好，而且回收率符合要求。

6、?為達(dá)到以上目的，采取以下技術(shù)方案實現(xiàn)：一種檢測赭曲霉毒素a的適配體傳感器的制備方法，其特征在于：（1）適配體傳感器制備前裸玻碳電極的清洗、活化和性能測試，如果測試循環(huán)伏安曲線中的峰電位差在100?mv以下，氧化峰和還原峰對稱，則所述的玻碳電極可使用，否則要重新返回清洗步驟中，直到符合。（2）清洗好的玻碳電極表面滴涂分散均勻的ti3c2tx?mxene，繼而修飾聯(lián)呲啶釕-殼聚糖（ru(bpy)32+-cs）溶液，通過殼聚糖中的羥基和適配體互補(bǔ)鏈中的氨基進(jìn)行羥氨基化，使得cdna能夠牢固地固定在電極表面。滴涂bsa溶液以封閉非特異性位點，將修飾有適配體的cds溶液（cds-apt）滴加在電極上，最后加入靶標(biāo)物質(zhì)。適配體傳感器制備結(jié)束后，放入4℃冰箱里保存?zhèn)溆谩?/p>

7、為達(dá)到以上目的，采取以下技術(shù)方案實現(xiàn)：一種檢測赭曲霉毒素a的適配體傳感器的制備方法，其特征在于：（1）將上述制備好的適配體傳感器在工作底液中用電化學(xué)發(fā)光方法檢測，得到峰值和靶標(biāo)物質(zhì)的關(guān)系；（2）配置一系列的ota濃度標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光方法測定，進(jìn)一步得到上述制備的適配體傳感器的工作曲線、檢測范圍和檢測限；（3）配置一系列常見的霉菌毒素溶液，以檢測所制備的適配體傳感器的選擇性；（4）使用電化學(xué)發(fā)光法多次驗證上述適配體傳感器的穩(wěn)定性和重復(fù)性；（5）對實際谷物樣品進(jìn)行分析得出適配體傳感器的回收率。

8、?本發(fā)明提出的開關(guān)型電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器在赭曲霉毒素a的檢測中表現(xiàn)出優(yōu)異的分析性能，具有較高的靈敏度、較低的檢出限和較寬的檢測范圍，這得益于“開”階段與“關(guān)”階段之間較大的信號差異?！伴_”狀態(tài)是由ru(bpy)32+和cds?qds之間的電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)提供，產(chǎn)生了較高的背景信號?！瓣P(guān)”狀態(tài)是由通過ota的修飾使得cds-apt從電極表面釋放，從而導(dǎo)致發(fā)光信號的降低，達(dá)到“關(guān)”狀態(tài)。高強(qiáng)度的“開”信號和低強(qiáng)度的“關(guān)”信號保證了開關(guān)型電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的靈敏度。此外，所開發(fā)的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器成功地用于檢測小麥和燕麥樣品中的ota，證明了其在實際應(yīng)用中的實用性。

9、?所述適配體傳感器的制備工藝如下：將預(yù)處理后的gce依次滴入5?μl?ti3c2txmxene溶液，在室溫下自然干燥后，滴加5?μl?ru(bpy)32+-cs混合溶液。然后在電極表面滴入5?μl?cdna溶液，在37℃下孵育，殼聚糖中的羥基和適配體互補(bǔ)鏈中的氨基進(jìn)行羥氨基化，使得cdna能夠牢固地固定在電極表面。接下來，為了關(guān)閉非特異性結(jié)合位點，在電極表面涂上濃度為0.5%的bsa溶液。然后，將修飾有適配體的cds溶液（cds-apt）滴加在電極上，孵育45?min，使其與互補(bǔ)鏈結(jié)合，放入4℃的環(huán)境下避光保存，以待后續(xù)檢測實際樣品中的赭曲霉毒素a。所用氨基修飾的適配體互補(bǔ)鏈序列為：5′-nh2-tgtccgatgctccctttacgccacccacacccgatc-3′；所用二茂鐵修飾的適配體序列為：5′-?nh2-gatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca-3′。