本發(fā)明涉及一種基于數(shù)字顯微全息光路的細(xì)胞振動(dòng)頻率檢測(cè)裝置及方法，屬于生物力學(xué)、光測(cè)力學(xué)，振動(dòng)檢測(cè)

背景技術(shù)：

1、生物化學(xué)和物理因素都與生命活動(dòng)有關(guān)。近年來，在對(duì)癌細(xì)胞和細(xì)菌的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞和細(xì)菌處于不斷的小運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，其運(yùn)動(dòng)能力與其代謝活動(dòng)有關(guān)。并且有證據(jù)表明，細(xì)胞的納米力學(xué)活動(dòng)具有一定的規(guī)律性，即在一定的頻帶內(nèi)運(yùn)動(dòng)。目前已有許多國內(nèi)外學(xué)者注意到這一點(diǎn)，開始研究細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)特征，在實(shí)驗(yàn)測(cè)試方面，利用細(xì)胞群體運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的機(jī)械波捕獲自發(fā)涌現(xiàn)、模式和頻率；利用微型懸臂梁測(cè)量卵母細(xì)胞的振動(dòng)特征；利用原子力顯微鏡轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂杏涗浐婉雎牷铙w生物樣本能力的超靈敏麥克風(fēng)檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞的振動(dòng)譜；而數(shù)字顯微全息技術(shù)是一種新興的技術(shù)，它結(jié)合了數(shù)字圖像處理和全息成像技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞振動(dòng)頻率的高精度測(cè)量。通過記錄細(xì)胞的全息圖像，可以捕獲細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)信息，并通過數(shù)字化處理技術(shù)提取出細(xì)胞振動(dòng)頻率隨時(shí)間的變化關(guān)系。數(shù)字顯微全息技術(shù)具有高分辨率、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、無需標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，為細(xì)胞振動(dòng)頻率檢測(cè)提供了新的可能性。目前，已經(jīng)有許多國內(nèi)外學(xué)者利用全息數(shù)字顯微的特點(diǎn)做了光學(xué)元件的改良并且得到了一些結(jié)果，比如：開發(fā)了衍射相和熒光顯微鏡作為同時(shí)定量相位成像和外顯熒光研究活細(xì)胞的新技術(shù)；開發(fā)了希爾伯特相位顯微鏡作為傅里葉相位顯微鏡的補(bǔ)充技術(shù)。

2、生物細(xì)胞相位顯微技術(shù)尤其是定量相位顯微技術(shù)能夠完全非侵人式無損傷地提供生物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)信息，為微觀領(lǐng)域中像生物細(xì)胞這類相位物體的研究提供了有力的手段。然而，生物細(xì)胞相位顯微技術(shù)中，傳統(tǒng)的細(xì)胞振動(dòng)頻率檢測(cè)方法通常依賴于顯微鏡觀察和圖像處理技術(shù)，因此，傳統(tǒng)方法存在一些局限性，例如分辨率不高、無法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、操作復(fù)雜等。此外，傳統(tǒng)方法往往需要使用標(biāo)記物或顯微熒光染料，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響或引入額外的誤差。細(xì)胞運(yùn)動(dòng)特性跟細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)，而使用一種經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、無接觸式的數(shù)字全息顯微技術(shù)測(cè)量細(xì)胞振動(dòng)頻率成為當(dāng)前生物力學(xué)研究的重要課題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種基于數(shù)字顯微全息光路的細(xì)胞振動(dòng)頻率檢測(cè)裝置及方法，該方法可以實(shí)現(xiàn)在全息干涉光路中搭載顯微鏡來接收細(xì)胞帶有深度信息的相位，測(cè)量細(xì)胞相位隨時(shí)間的變化，進(jìn)而通過傅里葉變換得到頻譜圖，通過識(shí)別主要的頻率成分，可以得到細(xì)胞的振動(dòng)特征。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種基于數(shù)字顯微全息光路的細(xì)胞振動(dòng)頻率檢測(cè)裝置及方法，其技術(shù)方案如下：

3、一種基于數(shù)字顯微全息光路的細(xì)胞振動(dòng)頻率檢測(cè)裝置，具體包括：

4、一塊光學(xué)被動(dòng)隔振平臺(tái)，搭置在光學(xué)被動(dòng)隔振平臺(tái)上的光學(xué)全息系統(tǒng)、顯微系統(tǒng)、數(shù)字顯微處理系統(tǒng)，所述光學(xué)全息系統(tǒng)將其內(nèi)部發(fā)出的激光分為物光和參考光，物光經(jīng)過全反鏡后通過顯微系統(tǒng)，參考光經(jīng)過全反鏡后與攜帶物體信息的物光發(fā)生干涉，由于相位差而形成明暗相間的干涉條紋，利用數(shù)字顯微處理系統(tǒng)將條紋解碼為相位，利用傅里葉變換計(jì)算頻譜。

5、所述光學(xué)被動(dòng)隔振平臺(tái)上的顯微系統(tǒng)連接數(shù)字顯微處理系統(tǒng)。

6、光學(xué)全息系統(tǒng)包括：一個(gè)用于產(chǎn)生激光的氦氖激光器1、用于將激光分束為物光和參考光的分束鏡2、將物光反射形成回路的第一全反鏡3、將參考光反射形成回路的第二全反鏡13、將參考光發(fā)生衍射的擴(kuò)束鏡7、調(diào)節(jié)物光光強(qiáng)的衰減片4、將擴(kuò)束后參考光高頻率過濾的空間濾波器8、將擴(kuò)束和濾波后的球面波準(zhǔn)直的準(zhǔn)直透鏡9和用于物光和參考光產(chǎn)生干涉的合束鏡12；所述物光光路上的第一全反鏡3、衰減片4、包含細(xì)胞切片的載玻片5、合束鏡12位于同一光軸。

7、所述的氦氖激光器1發(fā)出的激光通過分束鏡2后分成物光和參考光，試件置于光學(xué)被動(dòng)隔振平臺(tái)上，物光通過第一全反鏡3折返行進(jìn)光路后依次通過衰減片4、顯微系統(tǒng)c，使光強(qiáng)和參考光相平衡，并攜帶細(xì)胞相位信息；參考光通過第二全反鏡13折返行進(jìn)光路后依次通過擴(kuò)束鏡7、空間濾波器8和準(zhǔn)直透鏡9，使平面波發(fā)生衍射成為球面波，并過濾掉高頻率部分，再將光路準(zhǔn)直變?yōu)槠矫娌?，最后和物光在合束鏡12處進(jìn)行干涉，產(chǎn)生攜帶細(xì)胞深度信息明暗相間的條紋。

8、顯微系統(tǒng)包括：顯微物鏡6、包含細(xì)胞切片的載玻片5和可調(diào)節(jié)高度的夾具裝置14；所述顯微物鏡6、包含細(xì)胞切片的載玻片5和可調(diào)節(jié)高度的夾具裝置14位于同一光軸上。

9、所述物光依次通過被可調(diào)節(jié)高度的夾具裝置14所持舉的包含細(xì)胞切片的載玻片5、顯微物鏡6；所述的夾具可調(diào)節(jié)高度使得載玻片上的細(xì)胞被物光穿過，所述顯微物鏡6接收由衰減片4平衡光強(qiáng)后的物光后，放大夾具裝置14所持舉的包含細(xì)胞切片的載玻片5。

10、數(shù)字顯微處理系統(tǒng)包括：ccd攝像機(jī)10和計(jì)算機(jī)11；所述的顯微物鏡接收由衰減片4平衡光強(qiáng)后的物光后，放大夾具裝置14所持舉的包含細(xì)胞切片的載玻片5。

11、所述計(jì)算機(jī)接收ccd攝像機(jī)10所捕捉到的蘊(yùn)含細(xì)胞深度信息的條紋。

12、一種基于數(shù)字顯微全息的細(xì)胞振動(dòng)頻率檢測(cè)方法，具體包括如下步驟：

13、s1、調(diào)節(jié)光路元件，將夾具調(diào)整至適當(dāng)高度，并放上包含細(xì)胞切片的載玻片5，將夾具裝置14夾緊，使得所述載玻片不輕易搖晃；

14、s2、打開氦氖激光器1，使得發(fā)出的激光通過分束鏡2，分束成物光和參考光；對(duì)于初始物光o(x,y)來說，通過衰減片4，調(diào)節(jié)通過光束的強(qiáng)弱，保持強(qiáng)度和參考光相同，依次經(jīng)過包含細(xì)胞切片的載玻片5和顯微物鏡6，攜帶細(xì)胞相位信息此時(shí)物光的表達(dá)式如下：

15、

16、式中：o(x,y)為初始物光，|o(x,y)|為物光振幅分布，為攜帶細(xì)胞相位信息，為初始相位；

17、對(duì)于未攜帶細(xì)胞信息的參考光來說，依次通過擴(kuò)束鏡7和空間濾波器8，使得平面波變成球面波，再過濾掉高頻部分雜散光，再通過準(zhǔn)直鏡9使得球面波變回平面波，此時(shí)參考光光場(chǎng)的表達(dá)式如下：

18、

19、式中：r(x,y)為參考光光場(chǎng)，|r(x,y)|為參考光振幅分布，為初始相位；

20、最后在合束鏡12處與物光合束，此時(shí)參考光與物光相互干涉從而記錄的全息條紋圖灰度分布如下式：

21、i(x,y)＝(o(x,y)|2+|r(x,y)2)+o(x,y)r*(x,y)+o*(x,y)r(x,y)

22、式中：*表示復(fù)共軛函數(shù)。

23、s3、當(dāng)物光經(jīng)過樣本時(shí)，由于樣本不同部位存在高度差，結(jié)合樣本折射率共同導(dǎo)致扭曲變形，因此采集到的樣本全息圖中條紋的彎曲與樣本高度信息對(duì)應(yīng)，由參考光和物光相互干涉從而記錄的全息圖中背景光強(qiáng)a(x,y)、干涉條紋的幅值b(x,y)，以及x,y方向上干涉條紋空間頻率f0x，f0y干涉條紋的分布，全息條紋圖灰度分布可由下式得到：

24、i(x,y)＝a(x,y)+c(x,y)exp[j(2πf0x+2πf0y)]+c*(x,y)exp[-j(2πf0x+2πf0y)]

25、式中：*表示復(fù)共軛函數(shù)，c(x,y)為細(xì)胞復(fù)振幅(等于光波復(fù)振幅)：

26、

27、對(duì)全息條紋圖進(jìn)行傅里葉變換：

28、f{i(x,y)}＝i(fx,fy)＝a'(fx,fy)+c'*(fx+f0x,fy+f0y)+c'(fx-f0x,fy-f0y)

29、式中：(fx,fy)為頻域內(nèi)坐標(biāo)，a'(fx,fy)為零級(jí)像頻譜，c'*(fx+f0x,fy+f0y)是共軛像頻譜，c'(fx-f0x,fy-f0y)是實(shí)像頻譜，包含細(xì)胞的相位信息，為了將包含細(xì)胞相位的頻率部分濾出，利用高斯濾波對(duì)干涉條紋傅里葉變換后的頻譜圖進(jìn)行處理得到c'(f0x,f0y)，對(duì)該頻率分量作傅里葉逆變換，得到與干涉條紋的空間頻率對(duì)應(yīng)的復(fù)振幅c(x,y),a'(fx,fy)表示背景光強(qiáng)a(x,y)的傅里葉變換所得到的；

30、取其中實(shí)像頻譜做逆傅里葉變換得到細(xì)胞復(fù)振幅c(x,y)。

31、s4、對(duì)細(xì)胞復(fù)振幅進(jìn)行反正切運(yùn)算，可以得到與之對(duì)應(yīng)的細(xì)胞包裹相位分布：

32、

33、式中，im[c(x,y)]表示c(x,y)的虛部，re[c(x,y)]表示c(x,y)的實(shí)部；

34、s5、利用vde-net卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)包裹相位信息進(jìn)行解包裹處理，可得到細(xì)胞的相位信息。將包裹相位圖像分別進(jìn)行相鄰行相鄰列相減，再將相減結(jié)果進(jìn)行二值化處理得到行邊緣圖像和列邊緣圖像：

35、

36、

37、式中，為行邊緣圖像，為列邊緣圖像，為包裹相位圖像在點(diǎn)(x.y)處的橫向相位梯度，為包裹相位圖像在點(diǎn)(x.y)處的縱向相位梯度；

38、將行邊緣圖像和列邊緣圖像進(jìn)行位或運(yùn)算，得到跳變邊緣圖像：

39、

40、式中，為包裹相位圖像對(duì)應(yīng)的跳變邊緣圖像；

41、對(duì)跳變邊緣圖像的跳變邊緣區(qū)域和背景區(qū)域進(jìn)行加權(quán)，得到加權(quán)跳變邊緣圖像：

42、

43、式中，fe為跳變邊緣加權(quán)系數(shù)，fb為背景區(qū)域加權(quán)系數(shù)，為加權(quán)跳變邊緣圖像；

44、最后將加權(quán)跳變邊緣圖像與包裹相位圖像相乘，得到加權(quán)跳變邊緣掩膜圖像：

45、

46、式中，m(x,y)we為加權(quán)跳變邊緣掩膜圖像，為加權(quán)跳變邊緣圖像；

47、網(wǎng)絡(luò)使用預(yù)先訓(xùn)練好的網(wǎng)絡(luò)，如圖1所示，得到加權(quán)跳變邊緣掩膜圖像后，與包裹相位圖像在通道維度上組合，從而得到網(wǎng)絡(luò)的輸入圖像，該網(wǎng)絡(luò)具有兩個(gè)輸入，分別是包裹相位圖像及加權(quán)跳變邊緣掩模圖像，輸出是與包裹相位圖像相同尺寸的解包裹相位圖像；需要注意的是，加權(quán)跳變邊緣掩模圖像雖然作為輸入，但是并不會(huì)隨同包裹相位圖像一起參與網(wǎng)絡(luò)模型的訓(xùn)練與特征提取，而直接與網(wǎng)絡(luò)的特征圖在通道維度上組合作為空間注意力圖像，從而增強(qiáng)對(duì)跳變邊緣區(qū)域的注意力。

48、s6、對(duì)得到的真實(shí)相位在正方形區(qū)域內(nèi)取平均值，得到細(xì)胞正方形區(qū)域內(nèi)的相位平均值如下所示：

49、

50、式中：n為正方形區(qū)域內(nèi)的像素?cái)?shù)。

51、s7、對(duì)得到的隨時(shí)間變換的相位平均值變換做離散傅里葉變換，具體如下所示：

52、

53、式中：為細(xì)胞感興趣區(qū)域的相位平均值，j為虛數(shù)，n為點(diǎn)的數(shù)量，k取0,1……,n-1，對(duì)應(yīng)得到的頻譜圖(如圖4和5)即反映為細(xì)胞的振動(dòng)頻率。

54、通過上述步驟即可求出細(xì)胞振動(dòng)對(duì)應(yīng)頻域。

55、本發(fā)明的有益效果：

56、(1)無需標(biāo)記：相比傳統(tǒng)的顯微鏡技術(shù)，本發(fā)明使用的細(xì)胞定量相位成像不需要使用熒光染料或其他標(biāo)記物來標(biāo)記細(xì)胞結(jié)構(gòu)或分子，因此避免了標(biāo)記物對(duì)細(xì)胞活性和結(jié)構(gòu)的影響，同時(shí)簡化了實(shí)驗(yàn)步驟。

57、(2)高分辨率：數(shù)字全息技術(shù)具有比傳統(tǒng)顯微鏡更高的空間分辨率，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的更詳細(xì)和更精確的觀察。這使得細(xì)胞定量相位成像能夠提供更清晰、更準(zhǔn)確的細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)信息。

58、(3)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)：數(shù)字全息成像系統(tǒng)可以實(shí)時(shí)捕獲細(xì)胞的全息圖像，因此可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的形態(tài)和動(dòng)態(tài)變化，包括細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、變形、生長等過程。

59、(4)定量分析：相位信息可以提供有關(guān)細(xì)胞由于振動(dòng)而引起的相位變化信息。通過對(duì)相位圖像進(jìn)行定量分析，通過分析獲取的細(xì)胞振動(dòng)頻譜，有助于區(qū)分出正常細(xì)胞與異常細(xì)胞。

60、(5)非侵入性：本發(fā)明使用的方法是一種非侵入性的成像技術(shù)，不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生任何損傷或干擾。