本發(fā)明屬于生物，涉及能夠反應(yīng)雞熱應(yīng)激狀態(tài)的生物標(biāo)志物，具體為來源于雞的生物標(biāo)志物dnajb11及其篩選方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、因肉雞身覆羽毛且無汗腺，皮下及腹下脂肪多，造成其對高熱環(huán)境耐受力十分低下。因此，熱應(yīng)激（heat?stress，hs）便成為導(dǎo)致肉雞生產(chǎn)力下降和死亡率升高的重要原因之一。熱應(yīng)激不僅使雞的組織器官發(fā)育受到影響，免疫力、生產(chǎn)性能也顯著下降，甚至還會(huì)造成大量雞只的死亡。

2、心臟是動(dòng)物機(jī)體生命存活最重要的保障器官之一。而雞在熱應(yīng)激初期即可呈現(xiàn)出異乎尋常的高猝死現(xiàn)象。研究表明，熱應(yīng)激在體內(nèi)外水平上均可誘導(dǎo)雞心肌細(xì)胞發(fā)生以細(xì)胞腫脹、急性變性為特征的病理變化甚至是細(xì)胞凋亡、壞死，超微病理觀察則表現(xiàn)為亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)線粒體的腫脹、嵴脫落，光鏡下觀察熱應(yīng)激雞心肌組織則顯示有心肌纖維的斷裂。

3、當(dāng)暴露于熱應(yīng)激環(huán)境時(shí)，雞機(jī)體組織細(xì)胞會(huì)迅速合成一系列非特異性、保守性自我保護(hù)蛋白-熱休克蛋白（heat?shock?proteins，hsps）。它們能在急性過程中快速有效地修復(fù)細(xì)胞損傷，進(jìn)而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)機(jī)體熱耐受。dnajb11（dnaj?heat?shock?proteinfamily?(hsp40)?member?b11）是一種hsp40共伴侶蛋白，在眾多生物體中保守表達(dá)，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，常以四聚體形式在保障內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮核心作用。其功能涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所有分泌蛋白和膜蛋白的糖基化、折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)，控制失敗蛋白的降解，mrna修飾以及atp依賴酶的活性調(diào)節(jié)等。

4、受熱帶島嶼氣候影響，海南全年約2/3時(shí)間處于高溫狀態(tài)，雞只更是普遍遭受熱應(yīng)激，其中，列入國家畜禽遺傳資源保護(hù)名錄、占海南全省肉雞飼養(yǎng)出欄量71%的文昌雞具有公認(rèn)的優(yōu)良抗熱性狀。通過從解析文昌雞優(yōu)良抗熱性狀形成的生物學(xué)基礎(chǔ)出發(fā)，以期發(fā)現(xiàn)并確證調(diào)控雞只抗熱生存能力的關(guān)鍵分子，同時(shí)闡明其抵抗熱應(yīng)激損傷的分子機(jī)制，對于監(jiān)測、預(yù)防、緩解雞熱應(yīng)激損傷、研發(fā)有效制劑具有重大意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、解決的技術(shù)問題：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，在畜禽養(yǎng)殖過程中，能夠監(jiān)測畜禽的熱應(yīng)激狀態(tài)，且具有良好的特異性和靈敏度；另外，監(jiān)測畜禽自身是否能夠緩解熱應(yīng)激損傷或抗猝死能力；鑒于此，本發(fā)明提供了來源于雞的生物標(biāo)志物dnajb11及其篩選方法和應(yīng)用。

2、技術(shù)方案：來源于雞的生物標(biāo)志物dnajb11，所述生物標(biāo)志物為具有輔助伴侶功能的可溶性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)糖蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示：

3、mapgwlgrvcllllclcgeaaagrdfykilgvsrgasvkdikkayrklalqlhpdrnpddpraqekfqdlgaayevlsdeekrkqydaygeeglkdghqsshgdifshffgdfgfmfggnprqqdrniprgsdiivdlevtleevysgnfvevvrnkpvarqapgkrkcncrqemrttqlgpgrfqmtqevvcdecpnvklvneertleveiepgvrdgmeypfigegephvdgepgdlrfrikvlkhpvferrgddlytnvtislvealtgfemdithldghkvhvardkitkpgaklwkkgeglpnfdnnnikgsliitfdvefpkeqltseqreglkqllkqgsvqkvynglqgy。

4、優(yōu)選的，所述生物標(biāo)志物合成、分泌自雞心臟細(xì)胞，分泌水平隨熱應(yīng)激時(shí)間的延長而逐漸升高。

5、優(yōu)選的，所述生物標(biāo)志物分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。

6、以上任一所述來源于雞的生物標(biāo)志物dnajb11的篩選方法，所述方法包括以下步驟：

7、s1、將雞分為對照組和熱應(yīng)激處理組，熱應(yīng)激處理?xiàng)l件為溫度42±1℃、相對濕度65%、5h，處理后采集對照組(con)、熱應(yīng)激處理存活組(hss)、熱應(yīng)激處理死亡組(hsd)雞的心臟組織；

8、s2、將s1采集的三組心臟組織樣本分別混合后置于三個(gè)管中，進(jìn)行無標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)檢測，篩選差異表達(dá)蛋白；

9、s3、對s2中得到的組織進(jìn)行蛋白質(zhì)提取和消化，得到多肽，通過納米液相色譜質(zhì)譜法對多肽進(jìn)行分離和質(zhì)譜分析；

10、s4、將s3中掃描得到的原始ms文件使用蛋白質(zhì)組發(fā)現(xiàn)者軟件進(jìn)行處理和分析，篩選顯著上調(diào)蛋白和顯著下調(diào)蛋白；其中，上調(diào)倍數(shù)最高的蛋白質(zhì)即為生物標(biāo)志物dnajb11。

11、以上任一所述來源于雞的生物標(biāo)志物dnajb11在制備畜禽熱應(yīng)激狀態(tài)檢測試劑盒中的應(yīng)用。

12、優(yōu)選的，所述應(yīng)激狀態(tài)包括：畜禽是否發(fā)生熱應(yīng)激、熱應(yīng)激損傷加重、具有熱應(yīng)激猝死風(fēng)險(xiǎn)。

13、優(yōu)選的，所述試劑盒用于實(shí)時(shí)監(jiān)測畜禽養(yǎng)殖過程中的熱應(yīng)激狀態(tài)。

14、以上任一所述來源于雞的生物標(biāo)志物dnajb11在制備指示畜禽具有緩解熱應(yīng)激損傷或抵抗猝死能力的試劑盒中的應(yīng)用。

15、以上任一所述來源于雞的生物標(biāo)志物dnajb11在畜禽抗逆生物育種中的應(yīng)用。

16、以上任一所述來源于雞的生物標(biāo)志物dnajb11在制備畜禽抗熱應(yīng)激藥物中的應(yīng)用。

17、本發(fā)明所述生物標(biāo)志物dnajb11作用的原理在于：經(jīng)比較研究顯示，在極端熱應(yīng)激下（42±1℃，相對濕度65%），文昌雞的熱應(yīng)激（5h）終末死亡率為62.5%，而白羽肉雞為100%且大多在熱應(yīng)激3h左右或更早死亡。而體內(nèi)外研究表明，文昌雞在熱應(yīng)激條件下的心臟損傷程度也顯著輕于白羽肉雞，我們對熱應(yīng)激文昌雞心肌組織的病理學(xué)觀察也顯示，熱應(yīng)激存活組的損傷程度要明顯低于熱應(yīng)激死亡組。提示文昌雞的抗熱性能主要體現(xiàn)在高熱環(huán)境下的極強(qiáng)生存能力，心肌組織細(xì)胞抵抗熱應(yīng)激損傷的能力應(yīng)該是文昌雞抗熱生存能力的重要標(biāo)志。本發(fā)明在建立文昌雞熱應(yīng)激模型的基礎(chǔ)上，對con、hsd與hss三組文昌雞的心肌組織進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析。與con組相比，dnajb11在hsd組和hss組均顯著上調(diào)，且為hss組上調(diào)倍速最高的蛋白質(zhì)（圖4d）。我們隨后對dnajb11在熱應(yīng)激心肌組織中的表達(dá)進(jìn)行了蛋白免疫印跡試驗(yàn)作為驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)dnajb11在hsd組和hss組也均顯著上調(diào)，且hss組升高更明顯（圖5a）。對熱應(yīng)激原代文昌雞心肌細(xì)胞的檢測顯示，dnajb11表達(dá)水平隨著熱應(yīng)激時(shí)間的延長也顯著升高（圖5b），而白羽肉雞hs組的dnajb11的表達(dá)與con組相比，沒有顯著差異（圖5c）。綜合上述結(jié)果看，dnajb11與文昌雞的抗熱生存最具直接相關(guān)性，且極可能在心肌細(xì)胞抗熱應(yīng)激損傷過程中發(fā)揮重要積極作用。因此，我們選擇dnajb11作為指示雞抗熱應(yīng)激損傷能力的候選生物標(biāo)志物。

18、有益效果：（1）本發(fā)明所述生物標(biāo)志物能夠判斷雞是否處于熱應(yīng)激狀態(tài)、熱應(yīng)激水平、是否具有熱應(yīng)激猝死風(fēng)險(xiǎn)；（2）所述標(biāo)志物能夠指示畜禽是否具有緩解熱應(yīng)激損傷或抵抗猝死的能力；（3）所述標(biāo)志物具有良好的特異性和靈敏度；（4）所述生物標(biāo)志物在應(yīng)激檢測試劑盒開發(fā)、抗逆生物育種和抗應(yīng)激藥物研發(fā)中具有重要作用。