本發(fā)明屬于生物工程，具體涉及一種基于光激發(fā)電驅(qū)動活性氧通道的生物標(biāo)志物檢測方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、目前在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，分析腫瘤組織的標(biāo)志性核酸、蛋白質(zhì)等分子標(biāo)志物信息，已成為腫瘤圍術(shù)期診斷的一種有效方法。例如對microrna(mirna)的檢測。此外，血液蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物例如癌胚抗原(cea)也被認(rèn)為是乳腺癌和其他癌癥的生物標(biāo)志物。雖然目前國內(nèi)外研究者開發(fā)了多種基于光/電/化學(xué)模式的傳感方法對生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測，但在臨床前和臨床應(yīng)用中尚未得到廣泛認(rèn)可，造成這一重大挑戰(zhàn)的主要原因包括：(1)潛在癌癥相關(guān)mirna或蛋白質(zhì)釋放到胞外進(jìn)入血液循環(huán)后，由于稀釋效應(yīng)，其上調(diào)下調(diào)的變化程度變得不顯著，此外血漿中酶的降解效應(yīng)會導(dǎo)致微小變化的辨識度進(jìn)一步降低。(2)非特定來源的生物標(biāo)志物mirna或蛋白質(zhì)也可以在炎癥性疾病和各種器官中表達(dá)，導(dǎo)致檢測結(jié)果假陽性率高。統(tǒng)計(jì)表明，局部腫瘤微環(huán)境間質(zhì)液中疾病相關(guān)生物標(biāo)志物的濃度比血液中高1000-1500倍(adv.mater.2024,36,2307；mol.on-col.2021,15,429.)，因此分析間質(zhì)液中生物標(biāo)志物，可以有效克服血液樣本檢測的弊端。

2、此外，腫瘤微環(huán)境調(diào)控相關(guān)的mirna作為腫瘤進(jìn)展及轉(zhuǎn)移監(jiān)測指標(biāo)，微環(huán)境免疫及耐藥相關(guān)mirna可作為腫瘤伴隨診斷及預(yù)后分子指標(biāo)。因此，分析腫瘤組織的生物標(biāo)志物，可以有效緩解血液樣本檢測的多種弊端。但是目前大多數(shù)基于腫瘤組織生物標(biāo)志物檢測的電化學(xué)生物傳感器無法以樣品輸入信號直接輸出(sample-in-answer-out,siao)的方式運(yùn)行，也就是說，中間需要經(jīng)過多種信號的轉(zhuǎn)換或處理步驟，包括洗滌、靶標(biāo)標(biāo)記、添加試劑以處理樣品以及放大和轉(zhuǎn)導(dǎo)信號等，才能得到最終的結(jié)果。如果是遇到未經(jīng)處理的臨床樣品，目前常用的電化學(xué)生物傳感器甚至無法直接對未經(jīng)處理的臨床樣品中的待測生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測分析。

3、目前國內(nèi)外已有報(bào)道基于異相界面光電反應(yīng)構(gòu)建納米傳感用于檢測mirna的方法(anal.chem.2023,95,12097-12103)。然而，這些方法所采用的光電材料中電子-空穴復(fù)合時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于電子轉(zhuǎn)移至電極或者電極電子轉(zhuǎn)移至材料的時(shí)間，導(dǎo)致載流子重組，降低光電流信號，從而降低檢測靈敏度。此外異相反應(yīng)需要對電極進(jìn)行復(fù)雜的固載修飾步驟，還需反復(fù)洗滌去除未結(jié)合物質(zhì)，累積檢測誤差。

4、光激化學(xué)發(fā)光技術(shù)——一種新型的第四代化學(xué)發(fā)光技術(shù)，由于其是一種均相的反應(yīng)平臺，在檢測過程中無需分離系統(tǒng)，具有免洗、背景低，靈敏度高，重復(fù)性好且操作簡單耗時(shí)短的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)受到越來越多ivd企業(yè)的關(guān)注。光激化學(xué)發(fā)光技術(shù)又稱發(fā)光氧通道免疫分析(luminescent?oxygen?channeling?immunoassay,loci)技術(shù)，在1994被首次提出。目前也有利用該技術(shù)來對生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測的報(bào)道，然而也存在一些問題。也有報(bào)道的光激發(fā)化學(xué)發(fā)光氧通道免疫檢測作為一種常見的均相免洗檢測技術(shù)被用于蛋白質(zhì)分析(acsomega2022,7,2344-2355；anal.chem.2019,91,5777-5785.)，然而因其感光微球和發(fā)光微球構(gòu)筑復(fù)雜，發(fā)光物質(zhì)易被光漂白，且耗散性消耗發(fā)光微球內(nèi)的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光信號輸出不穩(wěn)定。又例如，公布號為cn117368483a(20240109)，發(fā)明名稱為“一種基于均相光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的腎損傷分子-1檢測方法及試劑盒”，該專利應(yīng)用雙抗夾心免疫法和光激化學(xué)發(fā)光特性對抗體進(jìn)行檢測。該專利方法是基于光輸入-光輸出原理，可能會存在光信號間相互干擾問題，此外，該方法需要大型的儀器才能實(shí)現(xiàn)，因此成本高昂。

5、綜上所述，有必要提出一種新的方法和策略，以彌補(bǔ)或緩解現(xiàn)有技術(shù)的不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種利用光激發(fā)電驅(qū)動活性氧通道來檢測生物標(biāo)志物的方法及相關(guān)應(yīng)用。光激發(fā)電驅(qū)動活性氧通道(light-initiatedelectrochemical-driven?reactive?oxygen?channel?assay,leoca)，屬于一種光激發(fā)同步電子轉(zhuǎn)移的均相檢測方法，其技術(shù)原理是經(jīng)激光照射供體-受體復(fù)合反應(yīng)體系后，供體產(chǎn)生單線態(tài)氧，受體捕獲所述單線態(tài)氧后產(chǎn)生氧化產(chǎn)物，隨后在電極界面經(jīng)歷完成級聯(lián)氧化還原循環(huán)并產(chǎn)生放大的電流信號；此過程為光化學(xué)氧化-電化學(xué)還原級聯(lián)電化學(xué)信號放大過程。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下。

2、一種光激發(fā)電驅(qū)動活性氧通道的檢測裝置，所述檢測裝置包括反應(yīng)模塊、光激發(fā)模塊、電驅(qū)動模塊和活性氧通道反應(yīng)試劑；

3、所述反應(yīng)模塊包括一個的反應(yīng)池(所述反應(yīng)池可選的為頂部開口)，所述反應(yīng)池被設(shè)置用于(內(nèi)部)放置待檢測生物樣本和所述活性氧通道反應(yīng)試劑；

4、所述光激發(fā)模塊包括至少一個激光發(fā)射器；

5、所述電驅(qū)動模塊包括至少一組電極和電信號讀取器；

6、所述活性氧通道反應(yīng)試劑包括含有光敏劑的供體珠復(fù)合物和含有多酚的受體珠復(fù)合物，所述供體珠復(fù)合物包括含有光敏劑的金屬有機(jī)框架與第1反應(yīng)物偶聯(lián)；所述受體珠復(fù)合物包括含有多酚的類黑色素納米顆粒與第2反應(yīng)物偶聯(lián)；所述第1反應(yīng)物和所述第2反應(yīng)物被設(shè)置用于連接或識別待檢測生物樣本中的靶標(biāo)物質(zhì)以形成供體珠-受體珠連接體；

7、在檢測時(shí)(當(dāng)靶標(biāo)存在時(shí))，所述至少一個激光發(fā)射器發(fā)出的激光照射到所述供體珠-受體珠連接體上，使所述供體珠復(fù)合物產(chǎn)生單線態(tài)氧擴(kuò)散至受體珠，所述受體珠復(fù)合物中的多酚捕獲所述單線態(tài)氧后被氧化產(chǎn)生苯醌；

8、所述被氧化產(chǎn)生含苯醌的受體珠在所述電極表面發(fā)生碰撞，所述電極上施加還原電壓觸發(fā)苯醌電化學(xué)還原為多酚，發(fā)生級聯(lián)氧化還原循環(huán)并產(chǎn)生放大的電流信號(此過程為光化學(xué)氧化-電化學(xué)還原級聯(lián)電化學(xué)信號放大過程)；

9、所述電信號讀取器被設(shè)置用于讀取所述電流信號。

10、進(jìn)一步，所述供體珠復(fù)合物包括選自鋯基金屬有機(jī)框架、釓基金屬有機(jī)框架和鐵基金屬有機(jī)框架的一種或多種金屬有機(jī)框架。

11、進(jìn)一步，所述受體珠復(fù)合物包括選自氟硼二吡咯、金屬酞菁和卟啉及其衍生物的一種或多種光敏劑。

12、進(jìn)一步，所述供體珠的粒徑范圍為60-200nm；所述受體珠的粒徑范圍為10-20nm。

13、進(jìn)一步，所述活性氧通道反應(yīng)器中的供體珠復(fù)合物與受體珠復(fù)合物的配置比例為1:10。

14、進(jìn)一步，所述供體珠-受體珠連接體的距離為小于200nm。

15、進(jìn)一步，所述待檢測生物樣本選自組織間質(zhì)液。

16、進(jìn)一步，所述待檢測生物樣本還可以選自血液、尿液、體液和其組合物中的至少一種。

17、進(jìn)一步，所述待檢測生物樣本中的靶標(biāo)物質(zhì)包括核酸或蛋白；當(dāng)所述靶標(biāo)物質(zhì)為核酸時(shí)，所述第1反應(yīng)物和所述第2反應(yīng)物為第1發(fā)夾核酸和第2發(fā)夾核酸；當(dāng)所述靶標(biāo)物質(zhì)為蛋白時(shí)，所述第1反應(yīng)物和所述第2反應(yīng)物為捕獲抗體和檢測抗體。

18、進(jìn)一步，所述電驅(qū)動模塊被設(shè)置在所述反應(yīng)池的底部，被設(shè)置為用于提供電壓和讀取電信號；所述光激發(fā)模塊被設(shè)置在所述反應(yīng)池的頂部和/或側(cè)面。

19、進(jìn)一步，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，所述類黑色素納米顆粒為聚多巴胺，但這并不是限制。

20、類黑色素納米顆粒為含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)和多酚基團(tuán)的單體經(jīng)水溶液中氧化聚合之后的納米尺度的產(chǎn)物。還可以選自異黑色素、聚左旋多巴、聚沒食子酸或聚咖啡酸等。

21、一種利用上述光激發(fā)電驅(qū)動活性氧通道的檢測裝置來檢測生物標(biāo)志物的方法，所述生物標(biāo)志物包括核酸或蛋白，檢測步驟如下：

22、s01：在所述反應(yīng)模塊的反應(yīng)池內(nèi)加入待測生物樣本，當(dāng)所述待測生物樣本中含有靶標(biāo)核酸時(shí)，所述靶標(biāo)核酸能夠識別響應(yīng)第1發(fā)夾核酸并觸發(fā)所述第1發(fā)夾核酸中裸露單鏈區(qū)域從而誘導(dǎo)第2發(fā)夾核酸鏈雜交，經(jīng)過發(fā)夾核酸的雜交自組裝得到靶標(biāo)核酸的供體珠-受體珠連接體；或者，當(dāng)所述待測樣本中含有靶標(biāo)抗原時(shí)，所述靶標(biāo)抗原能夠識別并結(jié)合所述捕獲抗體和所述檢測抗體形成夾心免疫結(jié)構(gòu)，得到靶標(biāo)抗原的供體珠-受體珠連接體，所述供體珠-受體珠連接體的距離為小于200nm；

23、s02：打開所述光激發(fā)模塊的激光發(fā)射器，所述激光發(fā)射器發(fā)出的激光照射到所述供體珠-受體珠連接體上，其中供體珠復(fù)合物產(chǎn)生單線態(tài)氧，所述單線態(tài)氧在所述待測生物樣本中擴(kuò)散，受體珠復(fù)合物中的多酚捕獲所述單線態(tài)氧后被氧化產(chǎn)生苯醌；

24、s03：同時(shí)打開所述電驅(qū)動模塊的電極和電信號讀取器，所述產(chǎn)生苯醌的受體珠在所述電極表面發(fā)生碰撞，所述電極上施加還原電壓觸發(fā)苯醌電化學(xué)還原為多酚，發(fā)生級聯(lián)氧化還原循環(huán)并產(chǎn)生放大的電流信號(此過程為光化學(xué)氧化-電化學(xué)還原級聯(lián)電化學(xué)信號放大過程)，所述電信號讀取器讀取電流信號(所述電流信號可以是電流強(qiáng)度)；

25、s04：預(yù)先根據(jù)所述靶標(biāo)核酸或所述靶標(biāo)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和電流強(qiáng)度值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；

26、s05：將所述電信號讀取器讀取到的所述電流強(qiáng)度信號帶入所述標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到所述待測生物樣本的所述靶標(biāo)核酸或所述靶標(biāo)抗原的含量。

27、進(jìn)一步，所述第1發(fā)夾核酸的序列包括如seq?id?no.1或seq?id?no.3所示；所述第2發(fā)夾核酸的序列包括如seq?id?no.2或seq?id?no.4所示；所述靶標(biāo)抗原包括癌胚抗原。

28、一種利用光激發(fā)電驅(qū)動活性氧通道來檢測生物標(biāo)志物的方法，所述生物標(biāo)志物為核酸，包括以下步驟：

29、s01：制備含有光敏劑的供體珠復(fù)合物，所述供體珠復(fù)合物為含有光敏劑的金屬有機(jī)框架與第1發(fā)夾核酸偶聯(lián)；

30、s02：制備含有多酚的受體珠復(fù)合物，所述受體珠復(fù)合物為類黑色素納米顆粒與第2發(fā)夾核酸偶聯(lián)；

31、s03：將所述供體珠復(fù)合物與所述受體珠復(fù)合物放入待測生物樣本溶液中，當(dāng)所述待測生物樣本中含有靶標(biāo)核酸時(shí)，所述靶標(biāo)核酸能夠識別響應(yīng)所述第1發(fā)夾核酸并觸發(fā)所述第1發(fā)夾核酸中裸露單鏈區(qū)域從而誘導(dǎo)所述第2發(fā)夾核酸鏈雜交，經(jīng)過發(fā)夾核酸的雜交自組裝形成供體珠-受體珠連接體，所述供體珠-受體珠連接體的距離為小于200nm；

32、s04：將所述供體珠-受體珠連接體加到電極界面上，施加-0.8～-0.1v電壓，并給予所述供體珠-受體珠連接體激光照射，所述供體珠-受體珠連接體中的供體珠經(jīng)過激光照射產(chǎn)生單線態(tài)氧，所述單線態(tài)氧在所述待測生物樣本中擴(kuò)散，受體珠中的多酚捕獲所述單線態(tài)氧后被氧化產(chǎn)生苯醌，在電極界面施加還原電壓觸發(fā)苯醌電化學(xué)還原為多酚，發(fā)生級聯(lián)氧化還原循環(huán)并產(chǎn)生放大的電流信號，讀取電流信號；

33、s05：預(yù)先根據(jù)所述靶標(biāo)核酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和電流強(qiáng)度值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；

34、s06：將讀取到的所述電流信號帶入所述標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到所述待測生物樣本的所述靶標(biāo)核酸的含量。

35、進(jìn)一步，所述供體珠復(fù)合物包括選自鋯基金屬有機(jī)框架、釓基金屬有機(jī)框架和鐵基金屬有機(jī)框架的一種或多種金屬有機(jī)框架。

36、進(jìn)一步，所述金屬有機(jī)框架與所述第1發(fā)夾核酸通過酰胺鍵共價(jià)偶聯(lián)；所述類黑色素納米顆粒與所述第2發(fā)夾核酸通過邁克爾加成反應(yīng)共價(jià)偶聯(lián)。

37、進(jìn)一步，所述供體珠的粒徑范圍為60-200nm；所述受體珠的粒徑范圍為10-20nm。

38、進(jìn)一步，所述受體珠復(fù)合物包括選自氟硼二吡咯、金屬酞菁和卟啉及其衍生物的一種或多種光敏劑。

39、進(jìn)一步，將偶聯(lián)有第1發(fā)夾核酸的供體珠復(fù)合物與偶聯(lián)有第2發(fā)夾核酸的受體珠復(fù)合物按照1:10的比例混合。

40、進(jìn)一步，所述第1發(fā)夾核酸的序列包括如seq?id?no.1或seq?id?no.3所示；所述第2發(fā)夾核酸的序列包括如seq?id?no.2或seq?id?no.4所示。

41、進(jìn)一步，所述供體珠復(fù)合物中含有的光敏劑為四羧基苯卟啉，施加的激光波長為630-660nm。

42、進(jìn)一步，在一些實(shí)施方式中，所述供體珠由四羧基苯基卟啉和八水氯氧化鋯在苯甲酸和n,n-二甲基甲酰胺中反應(yīng)得到，所述四羧基苯基卟啉和所述八水氯氧化鋯的質(zhì)量比為1/6-1/2。

43、進(jìn)一步，在一些實(shí)施方式中，所述受體珠為先將多巴胺分散在乙醇中，加入三羥甲基氨基甲烷酸鹽充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)，取反應(yīng)液與無水乙醇混勻后離心，取離心沉淀于氫氧化鈉溶液中超聲，調(diào)整ph為中性，冷凍干燥最終得到類黑色素納米顆粒受體珠。

44、進(jìn)一步，第1發(fā)夾核酸與供體珠偶聯(lián)、第2發(fā)夾核酸與受體珠偶聯(lián)在偶聯(lián)緩沖液中進(jìn)行，所述偶聯(lián)緩沖液包括10-20mmol/l三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、110-140mmol/l氯化鈉、1-5mmol/l氯化鉀、0.1-1.0mmol/l氯化鈣、0.1-1.0mmol/l氯化鎂和去離子水，ph值為中性。

45、一種利用光激發(fā)電驅(qū)動活性氧通道來檢測生物標(biāo)志物的方法，所述生物標(biāo)志物為蛋白，包括以下步驟：

46、s01：制備含有光敏劑的供體珠復(fù)合物，所述供體珠復(fù)合物為含有光敏劑的金屬有機(jī)框架與捕獲抗體偶聯(lián)；

47、s02：制備含有多酚的受體珠復(fù)合物，所述受體珠復(fù)合物為類黑色素納米顆粒與檢測抗體偶聯(lián)；

48、s03：將所述供體珠復(fù)合物與所述受體珠復(fù)合物放入待測生物樣本溶液中，當(dāng)所述待測生物樣本中含有靶標(biāo)抗原時(shí)，所述靶標(biāo)抗原能夠識別并結(jié)合捕獲抗體和檢測抗體形成夾心免疫結(jié)構(gòu)，形成供體珠-受體珠連接體，所述供體珠-受體珠連接體的距離為小于200nm；

49、s04：將所述供體珠-受體珠連接體加到電極界面上，施加-0.8～-0.1v電壓，并給予所述供體珠-受體珠連接體激光照射，所述供體珠-受體珠連接體中的供體珠經(jīng)過激光照射產(chǎn)生單線態(tài)氧，所述單線態(tài)氧在所述待測生物樣本中擴(kuò)散，受體珠中的多酚捕獲所述單線態(tài)氧后被氧化產(chǎn)生苯醌，在電極界面施加還原電壓觸發(fā)苯醌電化學(xué)還原為多酚，發(fā)生級聯(lián)氧化還原循環(huán)并產(chǎn)生放大的電流信號，讀取電流信號；

50、s05：預(yù)先根據(jù)所述靶標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和電流強(qiáng)度值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；

51、s06：將讀取到的所述電流信號帶入所述標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到所述待測生物樣本的所述靶標(biāo)抗原的含量。

52、進(jìn)一步，所述金屬有機(jī)框架與捕獲抗體通過酰胺鍵偶聯(lián)；所述類黑色素納米顆粒與檢測抗體通過邁克爾加成或席夫堿反應(yīng)偶聯(lián)。

53、進(jìn)一步，所述靶標(biāo)抗原包括癌胚抗原。

54、上述方法在制備光激發(fā)電驅(qū)動活性氧通道生物標(biāo)志物檢測試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

55、有益技術(shù)效果

56、本發(fā)明提供了一種利用光激發(fā)電驅(qū)動活性氧通道法對生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測的方法。本發(fā)明提供的活性氧通道反應(yīng)試劑中包含的供體珠復(fù)合物和受體珠復(fù)合物為在檢測體系中游離的納米顆粒，因此本發(fā)明方法采用免固載策略避免電極修飾，通過均勻傳質(zhì)碰撞，實(shí)現(xiàn)“免洗免分離”均相電化學(xué)，可重復(fù)檢測。此外，還能有效克服光致電化學(xué)需要反復(fù)洗滌和分離步驟去除引起背景信號的未結(jié)合物質(zhì)的缺陷，檢測靈敏度高。目前現(xiàn)有技術(shù)中往往需要將光電納米材料固載在電極上，修飾電極的不均勻性和修飾探針的不可控堆積密度，嚴(yán)重限制了電化學(xué)檢測的重復(fù)性；此外這些方法所采用的光電材料中電子-空穴復(fù)合時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于電子轉(zhuǎn)移至電極或者電極電子轉(zhuǎn)移至材料的時(shí)間，導(dǎo)致載流子重組，降低光電流信號，從而降低檢測靈敏度。

57、進(jìn)一步，本發(fā)明方法采用的策略是光能轉(zhuǎn)化為電能，即光輸入-電輸出。具體來說，施加負(fù)電位還原，避免生理基質(zhì)中電活性物質(zhì)干擾；在碰撞約束的瞬態(tài)活性氧通道-電子轉(zhuǎn)移級聯(lián)過程中，受體珠表面的氧化事件通過醌還原電位放大電流信號，從而獲得電信號，因此靈敏度高。

58、在針對具體核酸的檢測中，本發(fā)明采用催化發(fā)夾自組裝策略可以實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)循環(huán)放大，再結(jié)合受體珠的級聯(lián)氧化還原循環(huán)電子轉(zhuǎn)移信號放大策略，從而實(shí)現(xiàn)雙重協(xié)同電信號放大，提高檢測的靈敏度。此外，不需要復(fù)雜的rna提取、純化、多步驟分離洗滌過程。在具體針對蛋白的檢測中，本發(fā)明采用雙抗體結(jié)合待測抗原的夾心免疫結(jié)果，實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)信號放大。

59、最后，本發(fā)明提供的電化學(xué)工作站設(shè)備具有小型化，成本低，操作便捷，提供高效快捷檢測結(jié)果的優(yōu)勢，具有很好的產(chǎn)業(yè)化前景。