本發(fā)明屬于熒光蛋白檢測，涉及一種基于固相信號放大的單顆粒計數(shù)熒光蛋白檢測方法。

背景技術(shù)：

1、蛋白質(zhì)是疾病檢測、監(jiān)測和治療的重要生物標(biāo)志物。準(zhǔn)確測量生物體液中極低水平的蛋白質(zhì)生物分子在臨床疾病診斷、藥物篩選中至關(guān)重要。超靈敏的測量技術(shù)在臨床診斷中尤其重要，因為許多潛在的生物標(biāo)志物存在于可獲得的生物流體中，其水平(fm到am級別)遠(yuǎn)低于當(dāng)前實驗室方法的檢測極限。數(shù)字化測量方法，如數(shù)字化酶聯(lián)免疫吸附劑與傳統(tǒng)使用的分析技術(shù)(如常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附試驗)相比，已大大提高了測量靈敏度，最高可達(dá)1000倍。然而,數(shù)字測量技術(shù)的靈敏度仍然不足以用于許多診斷應(yīng)用，特別是用于測量疾病相關(guān)蛋白質(zhì)。

2、現(xiàn)有的數(shù)字elisa方法利用微孔或油包水滴來分離攜帶單一靶蛋白分子的單個珠子。目前最先進(jìn)的數(shù)字elisa技術(shù)是單分子陣列(simoa)，它可以捕獲抗體包被的順磁性單目標(biāo)分子珠粒和分離的單個珠粒成飛級微孔用于單分子計數(shù)。樣品中超過目標(biāo)分子數(shù)量的大量珠子用于確保數(shù)字測量，其中每個珠子有零或一個捕獲的目標(biāo)分子，并遵循泊松分布。每個捕獲的分子用生物素化的檢測器抗體標(biāo)記，形成免疫復(fù)合物三明治，然后用酶偶聯(lián)鏈親和素-β-半乳苷酶(sβg)標(biāo)記。隨后將微球連同熒光酶底物一起裝入微孔中，每個微孔最多可容納一個微球。在用油密封微孔后，在每個含有攜帶sβg分子的頭的孔中催化產(chǎn)生高濃度的局部熒光產(chǎn)物。因此，通過計數(shù)來測量目標(biāo)分子的數(shù)量“on”和“off”井。雖然simoa可以達(dá)到亞飛摩爾的檢測極限，并且是目前超靈敏蛋白質(zhì)檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但其靈敏度受到低采樣效率的限制。只有大約5％的微球可以通過重力加載到微孔中并進(jìn)行分析。在simoa最新開發(fā)的hd-x分析儀中，雖然利用外部磁力進(jìn)行珠粒加載，但分析珠粒的百分比仍保持在5％左右。為了提高采樣效率，許多基于液滴的單分子數(shù)字化方法被研究。例如通過在光纖束的末端蝕刻數(shù)萬個反應(yīng)容器并將其密封，形成了許多液滴；還通過在疏水表面使用微室陣列生成液滴，同時形成了超過106個液滴；還通過使用不同的方法，在微流控通道中產(chǎn)生高通量油包水的液用于單蛋白分子檢測?；跀?shù)字液滴的免疫測定已被證明具有高達(dá)60％的采樣效率，并且顯示出與當(dāng)前simoa技術(shù)相同或更高的靈敏度，最高可達(dá)一個數(shù)量級。雖然液滴微流體系統(tǒng)已經(jīng)為各種應(yīng)用建立了良好的基礎(chǔ)，但對高度控制，高通量液滴生成的需求引入了額外的制造和加工步驟，增加了設(shè)備的復(fù)雜性。此外，由于很大一部分液滴不含微珠，但仍必須進(jìn)行成像，因此無法實驗高通量的采樣。

3、雖然現(xiàn)有方法顯示了數(shù)字化檢測單蛋白的能力，但是檢測靈敏度和穩(wěn)定性受到以下幾個因素的限制，主要表現(xiàn)在：

4、(1)在現(xiàn)有檢測方法中，是在小體積的微孔溶液相中實現(xiàn)熒光信號分子的濃度放大，使用微流控芯片產(chǎn)生液滴，微孔陣列制造成本昂貴，設(shè)備需要專業(yè)人員的操作和維護(hù)；

5、(2)目前基于磁珠的數(shù)字化檢測方法中，選用的酪胺放大試劑多為商業(yè)的tyramide-alexa?fluor?488或其它小分子酪胺熒光試劑，檢測僅用少數(shù)熒光團(tuán)標(biāo)記的單個抗體的挑戰(zhàn)導(dǎo)致單個標(biāo)記的信噪比非常低，因此需要使用昂貴且復(fù)雜的激發(fā)光源和檢測器，未有熒光量子點納米材料被用于信號放大；

6、(3)在磁珠分析過程中為了提高采樣率，采用流式細(xì)胞儀技術(shù)對磁珠進(jìn)行分析，需要專業(yè)的操作人員和昂貴且復(fù)雜的激發(fā)光源和檢測器；

7、綜上所述，如何實現(xiàn)低成本、檢測過程簡單以及高靈敏檢測方法，是單顆粒計數(shù)熒光蛋白檢測分析的發(fā)展方向。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有檢測時存在靈敏度低、操作復(fù)雜以及成本高的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種基于磁場輔助單顆粒分散和固相界面信號放大的單顆粒計數(shù)蛋白檢測方法。

2、本發(fā)明采用酪酰胺固相界面信號放大技術(shù)，將信號分子酪胺化cds量子點沉積到磁珠表面，實現(xiàn)固相界面的信號放大；再借助磁場輔助提升磁珠免疫復(fù)合物分散均勻性，簡化檢測過程，提升靈敏度，降低檢測成本。

3、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

4、一種基于固相信號放大的單顆粒計數(shù)熒光蛋白檢測方法，包括以下步驟：

5、s1、制備磁珠免疫復(fù)合物

6、分別取捕獲磁珠溶液、抗體溶液和已知濃度的抗原蛋白溶液，制備得到磁珠免疫復(fù)合物；

7、s2、磁珠表面原位熒光信號放大

8、向步驟s1所得的磁珠免疫復(fù)合物中分別加入過氧化氫溶液和信號分子溶液，孵育完成酪酰胺固相界面信號放大，得到負(fù)載有信號分子的磁珠免疫復(fù)合物，并分散于水中；所述信號分子溶液為信號分子酪胺化cds量子點溶液；

9、s3、磁珠免疫復(fù)合物的均勻分散

10、在磁場作用下，將負(fù)載有信號分子的磁珠免疫復(fù)合物均勻分散到蓋玻片表面上；

11、s4、計算負(fù)載有信號分子的磁珠免疫復(fù)合物對應(yīng)的amb值

12、s4.1、將步驟s3分散有負(fù)載有信號分子的磁珠免疫復(fù)合物的蓋玻片放置于倒置熒光顯微鏡上，以汞燈為光源，分別獲取bg系列熒光圖像和sg系列熒光圖像；

13、s4.2、對bg系列熒光圖像和sg系列熒光圖像分別進(jìn)行自動化批量分析處理，通過單顆粒計數(shù)方法，得到陽性磁珠數(shù)和總磁珠數(shù)，進(jìn)一步計算得到平均每個磁珠上的抗原數(shù)，即amb值；

14、

15、其中：

16、n為陽性磁珠數(shù)；

17、n0為總磁珠數(shù)；

18、s5、獲得標(biāo)準(zhǔn)回歸方程

19、s5.1、參照步驟s1的方法改變加入抗原蛋白溶液的濃度，得到含有不同濃度抗原蛋白的磁珠免疫復(fù)合物，再參照步驟s2～步驟s4得到不同濃度下抗原蛋白磁珠免疫復(fù)合物對應(yīng)的amb值；

20、s5.2、以抗原蛋白溶液濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，amb值為縱坐標(biāo)，線性回歸擬合得到標(biāo)準(zhǔn)回歸方程：

21、amb＝m?ln?c+b

22、其中：

23、c為抗原蛋白溶液的濃度，mol/l；

24、m為斜率，b為常數(shù)；

25、s6、測定待測樣品的抗原蛋白濃度

26、取待測樣品，參照步驟s1～步驟s4的方法，得到含有待測樣品的磁珠免疫復(fù)合物對應(yīng)的amb值；代入步驟s5的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程中，得到待測樣品中抗原蛋白濃度大小。

27、進(jìn)一步限定，所述步驟s1中磁珠免疫復(fù)合物的具體過程是：

28、s1.1、取鏈酶親和素磁珠溶液和生物素標(biāo)記的一抗溶液混合，恒溫孵育后洗滌，并分散于pbs溶液中得到溶液a；

29、s1.2、取步驟s1.1的溶液a、已知濃度的抗原蛋白溶液和第一份pbs溶液反應(yīng)，洗滌，分散于第二份pbs溶液中得到溶液b；

30、s1.3、向步驟s1.2的溶液b中繼續(xù)加入hrp酶標(biāo)記的二抗溶液，恒溫孵育后，洗滌，分散于pbs溶液中得到磁珠免疫復(fù)合物。

31、進(jìn)一步限定，所述步驟s1.1中，所述磁珠溶液、生物素標(biāo)記的一抗溶液和pbs溶液的體積比為5:4:100；磁珠溶液濃度為10mg/ml；生物素標(biāo)記的一抗?jié)舛葹?.82mg/ml；避光孵育2h；pbs溶液濃度為10mmol/l，ph＝7.40。

32、進(jìn)一步限定，所述步驟s1.2中，所述溶液a、抗原蛋白溶液、第一份pbs溶液和第二份pbs溶液的體積比為2:2:16:19；反應(yīng)時間為2h；兩份pbs溶液濃度均為10mmol/l，ph＝7.40。

33、進(jìn)一步限定，所述步驟s1.3中，所述hrp酶標(biāo)記的二抗溶液、溶液a和pbs溶液的體積為1:2:19；hrp酶標(biāo)記的二抗?jié)舛葹?0μg/ml；避光孵育2h；pbs溶液濃度為10mmol/l，ph＝7.40。

34、進(jìn)一步限定，所述步驟s2中，所述磁珠溶液、過氧化氫溶液、信號分子溶液和水的體積比為4：2：1：4；過氧化氫溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)3％，信號分子溶液濃度為2.5mg/ml，磁珠溶液濃度為10mg/ml；避光孵育1h。

35、進(jìn)一步限定，所述步驟s3中分散的具體過程是：

36、s3.1、蓋玻片在超聲下清洗，并用氮氣吹干；

37、s3.2、在吹干后的蓋玻片下設(shè)置圓餅形強(qiáng)銣磁鐵；

38、s3.3、將負(fù)載有信號分子的磁珠免疫復(fù)合物滴于與強(qiáng)銣磁鐵相對一側(cè)的蓋玻片表面上，然后自然揮發(fā)干，完成分散。

39、進(jìn)一步限定，所述蓋玻片的厚度為0.15mm～0.3mm，所述強(qiáng)銣磁鐵的直徑為1cm。

40、進(jìn)一步限定，步驟s4.1中，bg系列熒光圖像和sg系列熒光圖像的獲取過程是：

41、選用激發(fā)濾光片為560±40nm、發(fā)射濾光片為630±75nm的通道進(jìn)行信號捕獲，曝光時間為20ms，獲取bg系列熒光圖像；

42、選用激發(fā)濾光片為360±50nm、發(fā)射濾光片為445±50nm的通道進(jìn)行信號捕獲，曝光時間為100ms，得到sg系列熒光圖像。

43、進(jìn)一步限定，步驟s4.2中，陽性磁珠數(shù)和總磁珠數(shù)的具體計算過程是：

44、s4.2.1、對bg系列熒光圖像，每張bg熒光圖像上所有磁珠區(qū)域的磁珠分別進(jìn)行識別，在每張bg熒光圖像上標(biāo)記出磁珠的位置輪廓，得到標(biāo)記的bg系列熒光圖像；

45、s4.2.2、對標(biāo)記的bg系列熒光圖像，將每張標(biāo)記的bg熒光圖像上所標(biāo)記出的磁珠位置輪廓添加到與bg熒光圖像相對應(yīng)的sg熒光圖像上，得到加載的sg系列熒光圖像；

46、s4.2.3、對加載的sg系列熒光圖像，統(tǒng)計每張加載的sg熒光圖像上所有磁珠的強(qiáng)度，得到加載的sg系列熒光圖像上所有磁珠的最大灰度值；

47、s4.2.4、按照設(shè)定的灰度值區(qū)間長度，對步驟4.2.3獲取的全部最大灰度值進(jìn)行頻率統(tǒng)計，計算最大灰度值小于或位于灰度值區(qū)間內(nèi)的磁珠數(shù)量，得到總磁珠數(shù)；同時計算全部最大灰度值的平均最大灰度值和標(biāo)準(zhǔn)偏差sd，設(shè)定平均最大灰度值+5sd為閾值，統(tǒng)計最大灰度值大于閾值的磁珠數(shù)量，得到陽性磁珠數(shù)。

48、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

49、1、本發(fā)明采用酪酰胺固相界面信號放大技術(shù)，將信號分子酪胺化cds量子點沉積到磁珠表面，實現(xiàn)固相界面的信號放大；再借助磁場輔助提升磁珠免疫復(fù)合物分散均勻性，便于對磁珠顆粒進(jìn)行統(tǒng)計，無需采用微流體陣列芯片或微孔陣列，簡化檢測過程，提升靈敏度，降低檢測成本。

50、2、本發(fā)明采用酪酰胺固相界面信號放大技術(shù)，避免了傳統(tǒng)單分子數(shù)字化檢測時，需要將磁珠固定在微孔后在每個微孔中進(jìn)行酶聯(lián)免疫信號放大的局限，直接在離心管中反應(yīng)，將信號探針沉積到夾心免疫復(fù)合物所在的磁珠表面，簡化了反應(yīng)合成過程。

51、3、本發(fā)明借助磁場，將磁珠復(fù)合物直接分散到蓋玻片上進(jìn)行熒光成像，與現(xiàn)有技術(shù)中先將形成免疫復(fù)合物的每個磁珠封裝進(jìn)單個液滴或單個微孔中，然后在溶液相中產(chǎn)生信號進(jìn)行成像觀察相比，本發(fā)明磁場分散能避免封裝過程中的磁珠損失，有效提高采樣效率，進(jìn)而提升測量靈敏度。

52、4、本發(fā)明采用磁場輔助的分散方式，避免了咖啡環(huán)效應(yīng)聚集，操作簡單；采用便宜的蓋玻片作為磁珠分散載體，避免價格昂貴的微孔陣列芯片的使用，降低檢測成本。

53、5、本發(fā)明樣品制備過程簡單，檢測時采用倒置熒光顯微鏡直接進(jìn)行成像，設(shè)備簡單，成本低，有利于檢測方法在實際中的推廣應(yīng)用。