本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及樣品中脂溶性維生素的檢測方法。

背景技術(shù)：

1、脂溶性維生素是指不溶于水而溶于脂肪類有機溶劑的維生素，包括例如維生素a、維生素d、維生素e和維生素k，其中維生素d包括例如維生素d2和維生素d3。脂溶性維生素的作用多種多樣，除了直接參與和影響特異性的代謝過程外，它們多半還與細胞內(nèi)核受體結(jié)合，影響特定基因的表達。脂溶性維生素在人體生長、代謝、發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。合理的維生素水平對維持人體健康十分重要，準確測定人體中脂溶性維生素的含量，可以指導(dǎo)人們科學(xué)合理的補充維生素，預(yù)防疾病，提高生活質(zhì)量，同時對脂溶性維生素缺乏或過量的臨床判斷、治療管理和生理評估具有輔助診斷的意義。對于脂溶性維生素的測定是臨床樣品中的一項重要任務(wù)。

2、目前，臨床上在測定樣品中的脂溶性維生素時，由于臨床樣品成分復(fù)雜，不能直接進行檢測，需要首先進行前處理，使樣品進行適當(dāng)?shù)姆蛛x和純化后才有可能進入后面的分析程序?，F(xiàn)有技術(shù)中采用的脂溶性維生素的前處理方法包括蛋白沉淀(ppt)、液液萃取法(lle)、固相萃取法(spe)等。然而，現(xiàn)有技術(shù)中的前處理方法存在著無法實現(xiàn)自動化和/或無法同時實現(xiàn)脂溶性維生素a、d、e、k的有效檢測的缺點。

3、cn113376270b公開了一種高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測血清中脂溶性維生素的樣品的蛋白沉淀的前處理方法，包括采用負壓裝置處理的步驟。此方法操作簡單，但由于蛋白沉淀實質(zhì)是對樣本進行的稀釋，因此上機樣本中待測物的濃度偏低，對測定儀器的靈敏度要求高；而且，方法中需要負壓操作，不利于實現(xiàn)操作流程全自動化。cn110779780a公開了一種高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測血清中脂溶性維生素的樣品前處理方法，其使用乙醇進行蛋白沉淀，并使用正己烷進行液液萃取、氮氣吹干萃取液、樣品復(fù)溶才可將樣品進樣分析。該方法實驗過程中涉及到萃取、氮吹等步驟，需要大量人工操作，不利于處理自動化；而且操作過程繁瑣，對實驗人員的要求高。cn111198238a公開的血清中維生素d的萃取方法及檢測方法，該方法首先對樣品進行蛋白沉淀，然后再將沉淀的混合溶液上樣至活性炭96孔板上，使用正己烷等強揮發(fā)試劑進行洗脫，氮氣吹干洗脫液后進行樣品的復(fù)溶，隨后利用固相萃取法選擇性吸附目標物。然而，實驗中固相萃取填料接觸到有機試劑之后會產(chǎn)生溶脹現(xiàn)象，會影響溶液通過固相萃取填料的流速，從而產(chǎn)生孔間均一性差的問題，而且氮氣吹干的處理也不利于處理自動化。cn114487209a公開了一種利用磁性固相萃取材料檢測血清中脂溶維生素a、維生素d和維生素e的檢測方法，該方法利用了外加磁場和磁性固相萃取填料(親水親脂平衡型磁性固相萃取磁珠，hlb磁珠)，然而，該方法對維生素a的檢測靈敏度不高且無法對維生素k進行檢測。

4、因此，當(dāng)前已有的方法尚不能實現(xiàn)對樣品中脂溶性維生素a、d、e、k的靈敏有效和/或自動化檢測。臨床檢測客觀上要求提供一種能克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的至少一個問題，特別是能有效檢測脂溶性維生素的方法；并優(yōu)選地能夠進一步實現(xiàn)檢測的自動化。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明人通過大量實驗研究意外發(fā)現(xiàn)，通過采用聚合物包覆的磁珠(尤其是疏水聚合物磁珠)接觸樣品，可以實現(xiàn)對多種脂溶性維生素的檢測，實現(xiàn)高的檢測靈敏度，并可進一步實現(xiàn)包括維生素k在內(nèi)的多種脂溶性維生素的同時檢測。

2、基于此發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的第一個方面，提供了一種檢測樣品中目標分析物的方法，包括使聚合物包覆的磁珠接觸樣品的步驟，其中所述目標分析物優(yōu)選是脂溶性維生素。

3、本發(fā)明所述的磁珠是一種磁性顆粒，其具有磁性核心和包覆在所述磁性核心表面的包被材料，所述包被材料是聚合物材料，尤其是疏水聚合物，例如烷基修飾的硅膠或苯乙烯基聚合物，所述烷基修飾的硅膠例如是c18或c8烷基修飾的硅膠，所述苯乙烯基聚合物例如是苯乙烯-二乙烯苯共聚物。

4、優(yōu)選地，所述磁珠具有適當(dāng)?shù)牧６?，例如，其具有的平均粒徑?～200μm，例如10～100μm或30～50μm。

5、在本發(fā)明中，所述“樣品”意指所意欲檢測的成分來自的產(chǎn)品形態(tài)。在本文中，所述樣品可以是指生物樣品，例如臨床樣品，其優(yōu)選選自全血、血漿、血清、尿液、唾液、淚液、膽汁、胃液、組織液和淋巴液。

6、在本發(fā)明中，所述磁珠具有磁性核心和包覆在所述磁性核心表面的聚合物。所述聚合物可以是苯乙烯基聚合物。苯乙烯基聚合物是指以苯乙烯為主要單體聚合而形成的聚合物，或稱為苯乙烯系聚合物。本文中的苯乙烯基聚合物可以是以苯乙烯為唯一單體形成的聚苯乙烯，也可以通過加入其它交聯(lián)劑(例如二乙烯基苯)形成的聚合物，例如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。所述聚合物可通過不同工藝(例如流化床工藝、反應(yīng)釜工藝)形成，可具有不同的交聯(lián)度。

7、在本發(fā)明中，所述磁珠的磁性核心包含磁性顆粒，所述磁性顆?？梢杂扇魏尉哂写判缘奈镔|(zhì)組成，優(yōu)選選自鐵、鈷、鎳的氧化物，更優(yōu)選四氧化三鐵。本領(lǐng)域已知，所述磁性核心可以采用任何合適的方法制備得到。

8、本發(fā)明人在研究中進一步發(fā)現(xiàn)，可以借助施加磁場的作用，進一步實現(xiàn)對樣品進行移動和/或分離。例如，通過施加磁場實現(xiàn)對樣品特別是液體(包括溶液或混懸液)的快速充分轉(zhuǎn)移，同時可避免磁性材料轉(zhuǎn)移過程中殘留導(dǎo)致堵塞色譜柱等問題?；诖税l(fā)現(xiàn)，可實現(xiàn)在施加磁場下對樣品進行移動和/或分離的自動化操作。

9、相應(yīng)地，在本發(fā)明的方法中，還包括在施加磁場下對樣品進行移動和/或分離的步驟。更具體地，所述施加磁場對樣品進行移動和/或分離的步驟是通過將磁體置于容納有樣品的容器的壁外側(cè)使得當(dāng)施加磁場時樣品被吸引到容器壁內(nèi)側(cè)來實現(xiàn)的，或者通過將磁體至于容器底部，從而轉(zhuǎn)移上機樣本，實現(xiàn)上機樣本中磁珠無殘留的問題。

10、在一些實施方案中，所述對樣品進行移動和/或分離是通過從容納有樣品和磁珠的容器中移出樣品而實現(xiàn)的，或者是通過從容納有樣品和磁珠的容器中移出磁珠而實現(xiàn)的。

11、在一些實施方案中，在施加磁場下對樣品進行移動和/或分離的步驟可通過將磁體置于容納有樣品的容器的側(cè)壁外使得當(dāng)施加磁場時樣品被吸到容器側(cè)壁上來實現(xiàn)，或者可通過將磁體插入到容納有樣品的容器中以及移出磁體來實現(xiàn)。

12、所述磁體可以是永磁體或電磁體，優(yōu)選為電磁體，其可通過通斷電的方式方便地控制磁場的存在和消失。在電磁體的情況下，還可以通過可編程邏輯控制器(plc)對電磁體的通斷電進行控制，以適應(yīng)樣品處理的全自動化需要。

13、在具體操作時，可將磁體置于或插入到容納有樣品的溶液或混懸液中。

14、在一個實施方案中，所述在施加磁場下對樣品進行移動和/或分離的步驟是通過將磁體置于容納有樣品的容器的側(cè)壁外，使得當(dāng)施加磁場時樣品被吸到容器側(cè)壁上來實現(xiàn)的。在一個更具體的實施方案中，所述磁體可存在于兩個位置：側(cè)吸位和底吸位。對于位于側(cè)吸位的磁體而言，所述磁體位于容納有樣品的溶液或混懸液的容器的側(cè)壁外面，使得當(dāng)施加磁場時(例如通過接通電磁體的電源或移動永磁體)樣品被吸到容器側(cè)壁上來；對于位于底吸位的磁體而言，所述磁體位于容納有樣品的溶液或混懸液的容器的底壁下面，使得當(dāng)施加磁場時(例如通過接通電磁體的電源或移動永磁體)樣品被吸到容器底壁上來。在一些實施方案中，可只存在側(cè)吸位的磁體；在另一些實施方案中，可只存在底吸位的磁體；在另一些實施方案中，可同時存在側(cè)吸位和底吸位的磁體。

15、通過磁體的位置和/或通斷電狀態(tài)的切換，配合轉(zhuǎn)移液體(溶液或混懸液)的操作，可有效實現(xiàn)液體在不同容器之間轉(zhuǎn)移的自動化操作。

16、此外，對于通過將磁體置于容納有樣品的溶液或混懸液的容器的側(cè)壁外使得當(dāng)施加磁場時樣品被吸到容器側(cè)壁上來實現(xiàn)在外加磁場下對樣品進行移動和/或分離而言，本發(fā)明通過“側(cè)吸位”磁體可以更好地實現(xiàn)液體的充分轉(zhuǎn)移。相比于磁體位于容器底壁下面的“底吸位”設(shè)計而言，側(cè)吸磁體可更有效避免底吸位磁場造成的液體損失(底部液體吸取不充分)以及磁性材料被吸走導(dǎo)致的磁性材料殘留和堵塞色譜柱等不足，以及使轉(zhuǎn)移操作方便，可實現(xiàn)自動化。

17、基于上述發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明所述的方法中，還包括在外加磁場下對樣品進行移動和/或分離的步驟。進一步地，所述在外加磁場下對樣品進行移動和/或分離的步驟是通過將磁體置于容納有樣品的溶液或混懸液的容器的側(cè)壁外，使得當(dāng)施加磁場時樣品被吸到容器側(cè)壁上來實現(xiàn)的，或者是通過將磁體插入到容納有樣品的溶液或混懸液中以及移出磁體來實現(xiàn)的。

18、在本發(fā)明的方法中，所述容器可以為多孔板或分離的管，所述多孔板例如是2孔板、4孔板、6孔板、12孔板、24孔板、48孔板或96孔板。

19、在本發(fā)明的方法中，可包括以下步驟：

20、a)使磁珠與樣品接觸以吸附樣品中的目標分析物；

21、b)施加磁場使得吸附了目標分析物的磁珠與未被吸附的樣品組分相分離；

22、c)使吸附了目標分析物的磁珠與洗脫劑相接觸，從而使得目標分析物從磁珠上進入洗脫劑中。

23、在本發(fā)明的一些實施方案中，還包括在步驟a之前還將活化和平衡磁珠的步驟，和/或在步驟b)之后和步驟c)之前淋洗吸附了目標分析物的磁珠的步驟，其中所述淋洗使得能夠從磁珠上移除目標分析物以外的非特異性吸附成分而保留或基本上保留目標分析物仍吸附在磁珠上。

24、在本發(fā)明的一些實施方案中，所述方法中對樣品進行移動和/或分離是通過在一容器中吸取液體(或流體)和到另一容器中釋放液體(或流體)來實現(xiàn)的。

25、在本發(fā)明的一些技術(shù)方案中，所述容器為多孔板或分離的管；例如2孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板等；所述容器可以具有u型或v型的底部形狀。

26、在本發(fā)明的一些技術(shù)方案中，用于活化的有機溶劑選自甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇及其組合，用于平衡的有機溶劑為水與選自甲醇、乙醇、乙腈和異丙醇的有機溶劑組成的混合溶劑，用于淋洗的溶劑為水或水與選自甲醇、乙醇、乙腈和異丙醇的有機溶劑組成的混合溶劑；用于洗脫的溶劑選自乙腈、甲醇、乙醇、異丙醇及其任意組合，或者水與乙腈、甲醇、乙醇或異丙醇的任意組合。優(yōu)選地，用于淋洗的淋洗試劑包括弱淋洗試劑和強淋洗試劑，所述弱淋洗試劑可含有80％-100％的水，所述強淋洗試劑可含有60％-90％的水。

27、在本發(fā)明的方法中，可通過移液針在容器中的上下移動實現(xiàn)樣品在不同容器之間的轉(zhuǎn)移。優(yōu)選地，所述移液針底座設(shè)置有彈性元件，使得移液針下移接觸容器底部時可以彈性回縮；優(yōu)選地，所述移液針底座設(shè)置有調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)，使得可以調(diào)節(jié)移液針尖端的停止位置，以盡可能靠近容器底部但又不損壞移液針和/或容器。

28、在本發(fā)明的方法中，還包括以下步驟：

29、采用分析方法對經(jīng)過聚合物處理的樣品進行分析，所述分析方法選自質(zhì)譜法和液相色譜法，包括其聯(lián)用，例如液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(lc-ms)和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(lc-ms/ms)。

30、在本發(fā)明的另一方面，提供了聚合物包覆的磁珠(例如苯乙烯基聚合物包覆的磁珠)用于檢測樣品中脂溶性維生素的用途。更具體地，使用質(zhì)譜或液相色譜法檢測所述脂溶性維生素。

31、在本發(fā)明的另一方面，進一步提供了一種脂溶性維生素檢測試劑盒或套件，其包括聚合物包覆的磁珠(例如苯乙烯基聚合物包覆的磁珠)和任選地作為參考物質(zhì)的脂溶性維生素。具體地，所述試劑盒用于質(zhì)譜或液相色譜法檢測所述脂溶性維生素。更具體地，所述試劑盒還包含洗脫劑以及任選地淋洗劑。在一些實施方案中，所述試劑盒或套件用于實施根據(jù)本發(fā)明所述的方法。

32、本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明中使用的磁珠(包括ps磁珠、hlb磁珠、c18磁珠、c8磁珠)均可有效用于檢測脂溶性維生素。特別是疏水聚合物磁珠(如苯乙烯基聚合物磁珠和c8或c18磁珠)，對5種常見脂溶性維生素(維生素a、維生素d2、維生素d3、維生素e和維生素k1)的抓取和吸附效果良好，尤其是對于維生素k(如維生素k1)的檢測，還要顯著優(yōu)于其他類型的磁珠。

33、術(shù)語說明

34、在本文中，術(shù)語“磁珠”、“磁性顆?！?、“磁性粒子”和“磁粒”可互換使用，表示帶有磁性的顆粒。

35、在本文中，“聚合物”系指高分子化合物，其相對分子質(zhì)量可從幾千到幾百萬，可以是許多相對分子質(zhì)量不同的同系物的混合物。

36、在本文中，“疏水聚合物”是指由所述聚合物形成的磁珠表面(包括內(nèi)部孔徑表面)呈疏水性的聚合物，例如苯乙烯基聚合物和烷基修飾硅膠聚合物，更具體地所述烷基修飾硅膠聚合物例如是c8或c18烷基修飾硅膠聚合物。由疏水聚合物包覆的磁珠在本文中稱為疏水聚合物磁珠，例如苯乙烯基聚合物磁珠、烷基修飾硅膠聚合物磁珠(尤其是c18或c8烷基修飾硅膠聚合物磁珠，本文中亦稱c18或c8硅膠磁珠、或者c18或c8磁珠)。

37、在本文中，“苯乙烯基聚合物”意指以苯乙烯為主要單體聚合而形成的聚合物，也可稱“苯乙烯系聚合物”。本文中的苯乙烯基聚合物可以是以苯乙烯為唯一單體形成的聚苯乙烯，也可以通過加入其它交聯(lián)劑(例如二乙烯基苯)形成的聚合物，例如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。所述聚合物可通過不同工藝(例如流化床工藝、反應(yīng)釜工藝)形成，可具有不同的交聯(lián)度。在本文中，苯乙烯-二乙烯苯共聚物是指以苯乙烯和二乙烯苯為單體聚合形成的聚合物，尤其包括以苯乙烯為單體以二乙烯基苯為交聯(lián)劑形成的共聚物。

38、在本文中，“苯乙烯基聚合物磁珠”意指由苯乙烯基聚合物包覆的磁珠，例如聚苯乙烯磁珠(ps磁珠)是指由聚苯乙烯聚合物包覆的磁珠，所述聚苯乙烯聚合物尤其是指由苯乙烯和二乙烯基苯交聯(lián)形成的聚合物。另外，本文中提到苯乙烯基聚合物磁珠時，意指所述聚合物的苯環(huán)上無修飾基團(尤其親水修飾基團)。

39、在本文中，“hlb磁珠”作為一種具體類型的聚合物包覆的磁珠，又稱為親水親脂平衡磁珠。聚合物可在親脂性的苯乙烯基骨架基礎(chǔ)上進一步包含親水基，典型的親水基可具有n-乙烯基吡咯烷酮結(jié)構(gòu)，也可具有例如羧基、磺酸基、胺基等結(jié)構(gòu)。通過親脂性結(jié)構(gòu)與親水基的適當(dāng)比例，實現(xiàn)在一定范圍內(nèi)的親水和親脂性質(zhì)的平衡。

40、在本文中，“c18磁珠”和“c8磁珠”作為具體類型的聚合物包覆的磁珠，分別是指以硅膠材料為骨架的并帶有c18或c8烷基修飾的包覆磁性核心的磁珠，例如由十八烷基三氯硅烷鍵合可以得到十八烷基硅膠聚合磁珠即c18磁珠，由辛烷三氯硅烷鍵合可以得到辛烷基硅烷聚合磁珠即c8磁珠。

41、在本文中，“使磁珠接觸樣品”意指使樣品暴露于磁珠，從而發(fā)生相互作用。

42、在本文中，脂溶性維生素是指不溶于水而溶于脂肪及非極性有機溶劑(如苯、乙醚及氯仿等)的一類維生素，包括維生素a、d、e、k等。維生素d是指屬于固醇類的環(huán)戊烷多氫菲類化合物，包括維生素d2和維生素d3，也包括其活性代謝形式例如25-羥基維生素d3、25-羥基維生素d2、1,25-二羥基維生素d3、24,25-二羥基維生素d3等。維生素k包括天然存在的維生素k1和k2等形式。

43、在本文中，當(dāng)提及檢測脂溶性維生素時，作為目標分析物可以檢測一種所述脂溶性維生素或者同時檢測更多種所述脂溶性維生素，所述脂溶性維生素選自維生素a、維生素d2、維生素d3、維生素e、維生素k1和維生素k2中之一或其任意組合，優(yōu)選同時檢測兩種或更多種所述脂溶性維生素。在僅檢測一種所述脂溶性維生素的具體實施方案中，所述脂溶性維生素優(yōu)選地是維生素k(例如維生素k1和/或k2)。在同時檢測兩種或更多種所述脂溶性維生素的具體實施方案中，所述脂溶性維生素優(yōu)選地至少包括維生素k(例如維生素k1和/或k2)，特別地所述脂溶性維生素還可以包括維生素a、維生素d2、維生素d3、維生素e、維生素k1和維生素k2中之一或其任意組合。

44、在本文中，粒徑意指顆粒群體的平均粒徑。粒徑的測量方法包括篩分法、顯微鏡法、沉降法、電阻法等。

45、在本文中，“液相色譜法”是指用液體作為流動相的色譜法，其固定相可以有多種形式?！百|(zhì)譜法”是指用電場和磁場將運動的離子(帶電荷的原子、分子或分子碎片，有分子離子、同位素離子、碎片離子、重排離子、多電荷離子、亞穩(wěn)離子、負離子和離子－分子相互作用產(chǎn)生的離子等)按它們的質(zhì)荷比分離后進行檢測的方法。本文中的液相色譜法或質(zhì)譜法還包括其組合或聯(lián)用方式，例如液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(lc-ms)和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(lc-ms/ms)等。

46、在本文中，用語“選自”意指可以是其后所列的某一選項，也可以是其中一個或更多個選項的組合。

47、在本文中，“活化”的目的是創(chuàng)造一個與樣品溶劑相溶的環(huán)境并去除容器內(nèi)雜質(zhì)；“平衡”的目的一方面是除去活化時殘留的有機溶劑，另一方面便于接受以水為主要溶劑的樣品，相當(dāng)于溶劑系統(tǒng)的轉(zhuǎn)換；“淋洗”意指用于洗去吸附在磁珠上的干擾組分但保留目標分子的操作。相應(yīng)地，“活化劑”、“平衡劑”和“淋洗劑”是指為完成上述活化、平衡和淋洗操作所需的試劑，特別是溶劑及溶劑組合。

48、在本文中，“保留目標分析物仍吸附在磁珠上”意指大部分目標分析物仍被保留吸附在磁珠上，例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％甚至至少98％的目標分析物仍被吸附在磁珠上。

49、在本文中，“樣品”系指所檢測的對象，可以是生物樣品，例如臨床樣品，包括全血、血漿、血清、尿液、唾液、淚液、膽汁、胃液、組織液和淋巴液等，可以是選自全血、血漿、血清、尿液、唾液、淚液、膽汁、胃液、組織液和淋巴液的生物材料，所述樣品可以是上述樣品之任意組合。所述樣品可以是液體或流體形式，甚至也可以是固體形式。固體形式的樣品可以任選地經(jīng)諸如勻漿的處理后進行檢測。