本發(fā)明涉及藥物分析，具體涉及一種冬蟲夏草粉末的鑒別方法。

背景技術(shù)：

1、冬蟲夏草粉末是麥角菌科真菌冬蟲夏草菌cordyceps?sinensis(berk.)sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上形成的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體的冬蟲夏草經(jīng)粉碎后的粉末，是我國傳統(tǒng)名貴滋補中藥材，在醫(yī)療保健領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用價值。冬蟲夏草真菌具有專一寄生屬性并需要特殊的生存環(huán)境，國內(nèi)研究者通過分離天然蟲草菌株進行深層發(fā)酵得到發(fā)酵蟲草菌粉，其主要化合物的種類與冬蟲夏草基本相同，但各化合物含量有所差異，這也導(dǎo)致其藥效價值與冬蟲夏草存在一定的差異，并且由于冬蟲夏草價格昂貴，而發(fā)酵蟲草菌粉生產(chǎn)成本低，資源豐富，價格低廉，并且粉末形態(tài)上與冬蟲夏草粉末極其相似，肉眼不易辨別，若進行鑒別，存在需要較為昂貴的設(shè)備、試劑，成本高，操作復(fù)雜，難度大，鑒別所需時間長，或者需要熟練的操作和豐富的鑒別經(jīng)驗等問題。

2、因此，為了防止不法商家使用發(fā)酵蟲草菌粉來冒充冬蟲夏草粉末，有必要建立一種快速、有效、便捷、低成本的方法對冬蟲夏草粉末進行鑒別。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案。

2、本發(fā)明提供一種鑒別冬蟲夏草粉末的方法，其包括：

3、(1)供試品溶液1制備：將供試品粉末與含腺苷的緩沖液混合，放置一定時間后，然后高溫處理，放冷至室溫，過濾，取續(xù)濾液，得到供試品溶液1；

4、(2)供試品溶液2的制備：將供試品粉末與緩沖液混合，放置一定時間后，然后高溫處理，放冷至室溫，過濾，取續(xù)濾液，得到供試品溶液2；

5、(3)對照品溶液的制備：用水溶解肌苷對照品，得到對照品溶液；

6、(4)肌苷檢測：分別檢測供試品溶液1、供試品溶液2和對照品溶液中的肌苷含量，計算供試品溶液1相比供試品溶液2的肌苷增加量；

7、(5)判定：根據(jù)供試品溶液1相比供試品溶液2的肌苷增加量判定供試品粉末是否為冬蟲夏草粉末。

8、在一些實施例中，所述步驟(1)中的含腺苷的緩沖液的ph為4-10，所述步驟(2)的緩沖液的ph與所述步驟(1)中的含腺苷的緩沖液的ph相同。在一些實施例中，所述步驟(1)中的含腺苷的緩沖液的ph為4、5、6、7、8、9或10，所述步驟(2)的緩沖液的ph與所述步驟(1)中的含腺苷的緩沖液的ph相同。

9、在一些實施例中，所述含腺苷的緩沖液的制備方法包括：用所述緩沖液溶解腺苷，得到所述含腺苷的緩沖液。

10、在一些實施例中，所述步驟(2)的緩沖液和所述步驟(1)中的含腺苷的緩沖液的緩沖液為tris-馬來酸緩沖液。

11、在一些實施例中，所述步驟(1)中的含腺苷的緩沖液的腺苷的濃度為0.5μmol/l-20μmol/l。在一些實施例中，所述步驟(1)中的含腺苷的緩沖液的腺苷的濃度為0.5μmol/l、1μmol/l、2μmol/l、3μmol/l、4μmol/l、5μmol/l、6μmol/l、7μmol/l、8μmol/l、9μmol/l、10μmol/l、11μmol/l、12μmol/l、13μmol/l、14μmol/l、15μmol/l、16μmol/l、17μmol/l、18μmol/l、19μmol/l或20μmol/l。在一些實施例中，所述步驟(1)中的含腺苷的緩沖液的腺苷的濃度為2μmol/l。

12、在一些實施例中，所述步驟(1)中，所述供試品粉末與含腺苷的緩沖液混合后于20℃-65℃放置一定時間后，然后高溫處理，放冷至室溫，過濾，取續(xù)濾液，得到供試品溶液1。在一些實施例中，所述步驟(1)中，所述供試品粉末與含腺苷的緩沖液混合后于20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃放置一定時間后，然后高溫處理，放冷至室溫，過濾，取續(xù)濾液，得到供試品溶液1。

13、在一些實施例中，所述步驟(2)中，所述供試品粉末與緩沖液混合后于20℃-65℃放置一定時間后，然后高溫處理，放冷至室溫，過濾，取續(xù)濾液，得到供試品溶液2；其中所述步驟(2)中所述放置的溫度與所述步驟(1)中所述放置的溫度相同。在一些實施例中，所述步驟(2)中，所述供試品粉末與緩沖液混合后于20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃放置一定時間后，然后高溫處理，放冷至室溫，過濾，取續(xù)濾液，得到供試品溶液2；其中所述步驟(2)中所述放置的溫度與所述步驟(1)中所述放置的溫度相同。

14、在一些實施例中，所述步驟(1)中的一定時間為至少10min，所述步驟(2)中的一定時間與所述步驟(1)中的一定時間相同。在一些實施例中，所述步驟(1)中的一定時間為10min-120min，所述步驟(2)中的一定時間與所述步驟(1)中的一定時間相同。在一些實施例中，所述步驟(1)中的一定時間為10min、20min、30min、35min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min、110min或120min，所述步驟(2)中的一定時間與所述步驟(1)中的一定時間相同。

15、在一些實施例中，所述步驟(1)中所述供試品粉末的重量與所述含腺苷的緩沖液的體積的比值為5mg/ml-200mg/ml；所述步驟(2)中所述供試品粉末的重量與緩沖液的體積的比值與所述步驟(1)中所述供試品粉末的重量與所述含腺苷的緩沖液的體積的比值相同。在一些實施例中，所述步驟(1)中所述供試品粉末的重量與所述含腺苷的緩沖液的體積的比值為5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、110mg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml、150mg/ml、160mg/ml、170mg/ml、180mg/ml、190mg/ml或200mg/ml；所述步驟(2)中所述供試品粉末的重量與緩沖液的體積的比值與所述步驟(1)中所述供試品粉末的重量與所述含腺苷的緩沖液的體積的比值相同。

16、在一些實施例中，所述步驟(3)中所得對照品溶液中的肌苷濃度為0.1mol/ml-2.5μmol/ml。在一些實施例中，所述步驟(3)中所得對照品溶液中的肌苷濃度為0.2μmol/ml-1.0μmol/ml。在一些實施例中，所述步驟(3)中所得對照品溶液中的肌苷濃度為0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.3μmol/ml、0.4μmol/ml、0.5μmol/ml、1.0μmol/ml、1.5μmol/ml、2.0μmol/ml或2.5μmol/ml。

17、在一些實施例中，所述高溫處理為于90℃-100℃處理。在一些實施例中，所述高溫處理為于90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃處理。

18、在一些實施例中，所述高溫處理的時間為5min-15min。在一些實施例中，所述高溫處理的時間為5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min或15min。

19、在一些實施例中，所述步驟(5)的判定為：

20、相比供試品溶液2，供試品溶液1中肌苷的增加量大于0.05μmol/100mg粉末的供試品為冬蟲夏草粉末；

21、相比供試品溶液2，供試品溶液1中肌苷的增加量小于或等于0.05μmol/100mg粉末的供試品為非冬蟲夏草粉末。

22、在一些實施例中，所述冬蟲夏草粉末為含冬蟲夏草蟲體的冬蟲夏草粉末。

23、在一些實施例中，所述步驟(4)采用高效液相色譜法進行肌苷檢測。

24、在一些實施例中，所述高效液相色譜法的色譜柱為親水性十八烷基硅烷鍵合硅膠。

25、在一些實施例中，所述高效液相色譜法的流動相包括流動相a和流動相b，所述流動相a為緩沖鹽水溶液，所述流動相b為流動相a與甲醇的體積比為85:15-90:10或為90:10的混合液；所述高效液相色譜法的洗脫方式為梯度洗脫。

26、在一些實施例中，所述高效液相色譜法的色譜柱為agilent?polaris?c18-a色譜柱或其等效色譜柱。

27、在一些實施例中，所述梯度洗脫為：

28、

29、

30、在一些實施例中，所述緩沖鹽水溶液的ph為5.3-6.3。在一些實施例中，所述緩沖鹽水溶液的ph為5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2或6.3。

31、在一些實施例中，所述緩沖鹽水溶液為磷酸鹽緩沖液。

32、在一些實施例中，所述緩沖鹽水溶液中的緩沖鹽為磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉中的至少一種。

33、在一些實施例中，所述緩沖鹽水溶液中緩沖鹽的濃度為0.01mol/l-0.10mol/l或為0.05mol/l。

34、在一些實施例中，所述緩沖鹽水溶液的制備方法包括：用0.05mol/l的磷酸氫二鉀水溶液調(diào)節(jié)0.05mol/l的磷酸二氫鉀水溶液至ph為5.3-6.3。

35、在一些實施例中，所述高效液相色譜法的檢測波長為255nm-265nm。在一些實施例中，所述高效液相色譜法的檢測波長為255nm、256nm、257nm、258nm、259nm、260nm、261nm、262nm、263nm、264nm或265nm。

36、在一些實施例中，所述高效液相色譜法的流速為0.5ml/min-0.7ml/min。在一些實施例中，所述高效液相色譜法的流速為0.6ml/min。

37、在一些實施例中，所述高效液相色譜法的柱溫為20℃-30℃。在一些實施例中，所述高效液相色譜法的柱溫為20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃

38、在一些實施例中所述流動相b為流動相a與甲醇的體積比為85:15、86:14、87:13、88:12、89:11或90:10的混合液。在一些實施例中，所述流動相b為流動相a與甲醇的體積比為90:10的混合液。

39、在一些實施例中，所述色譜柱的內(nèi)徑為2.0mm-4.6mm。在一些實施例中，所述色譜柱的內(nèi)徑為2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm、4.5mm或4.6mm。在一些實施例中，所述色譜柱的內(nèi)徑為4.6mm。

40、在一些實施例中，所述色譜柱的柱長為100mm-250mm。在一些實施例中，所述色譜柱的柱長為100mm、150mm、200mm或250mm。在一些實施例中，所述色譜柱的柱長為150mm。

41、在一些實施例中，所述色譜柱的填料粒徑為1.7μm-5μm。在一些實施例中，所述色譜柱的填料粒徑為1.7μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm或5μm。

42、在一些實施例中，所述色譜柱的內(nèi)徑為4.6mm，柱長為150mm，填料粒徑為5μm。

43、有益效果

44、相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

45、本發(fā)明所提供的鑒別方法設(shè)備簡單，成本低，難度小，準(zhǔn)確性高，速度快，可快速、有效、簡便、低成本地鑒別供試品粉末是否為冬蟲夏草粉末。

46、術(shù)語說明

47、在本發(fā)明的描述中，“多個”的含義是兩個或兩個以上，除非另有明確具體的限定。

48、術(shù)語“室溫”表示環(huán)境溫度，指溫度在大約10℃至大約30℃，或大約20℃至30℃，或大約25℃。

49、在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結(jié)合和組合。

50、術(shù)語“v/v”表示體積比。

51、術(shù)語“％vol”表示體積百分比。

52、在下面的內(nèi)容中，無論是否使用“大約”或“約”等字眼，所有在此公開了的數(shù)字均為近似值。每一個數(shù)字的數(shù)值有可能會出現(xiàn)1％、2％、5％、7％、8％、10％、15％或20％等差異。每當(dāng)公開一個具有n值的數(shù)字時，任何具有n+/-1％,n+/-2％,n+/-3％,n+/-5％,n+/-7％,n+/-8％,n+/-10％,n+/-15％or?n+/-20％值的數(shù)字會被明確地公開,其中“+/-”是指加或減。