本發(fā)明涉及農(nóng)藥殘留檢測(cè)，尤其涉及一種快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留的方法、試劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、農(nóng)藥在提升作物產(chǎn)量、防范病蟲害方面作用顯著。然而，其也帶來了一些負(fù)面影響，如農(nóng)藥殘留問題。農(nóng)藥殘留可能引發(fā)食物中毒、免疫系統(tǒng)失調(diào)、癌癥及其他疾病等健康風(fēng)險(xiǎn)，長(zhǎng)期接觸即使是低濃度的農(nóng)藥，也可能導(dǎo)致慢性健康問題與發(fā)育障礙。故而，為保障食品安全和人類健康，農(nóng)藥殘留檢測(cè)極為重要。

2、熒光探針技術(shù)因具有響應(yīng)快速、非侵入性、高靈敏度及適用于體內(nèi)成像等特點(diǎn)，成為生物監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。但現(xiàn)有的用于檢測(cè)農(nóng)藥殘留的特異性熒光探針技術(shù)面臨諸多挑戰(zhàn)，例如易受其他生物酶干擾、靈敏度欠佳、合成程序繁雜等，這限制了其在精準(zhǔn)檢測(cè)與生物成像方面的潛力。近紅外(nir)熒光探針可以建立一個(gè)穩(wěn)定、高效、安全的熒光系統(tǒng)，提高對(duì)活性物質(zhì)及其在生命系統(tǒng)中分布的精確檢測(cè)，為農(nóng)藥殘留的實(shí)時(shí)檢測(cè)提供了新途徑。

3、已有研究表明，多種農(nóng)藥可與羧基酯酶(ces)活性中心的絲氨酸產(chǎn)生反應(yīng)，抑制ces的活性，因而ces可當(dāng)作檢測(cè)農(nóng)藥的指示物。然而，基于超高靈敏度近紅外ces熒光探針檢測(cè)農(nóng)藥殘留的方法卻鮮有報(bào)道。

4、鑒于此，鑒于當(dāng)前狀況，研發(fā)一種依托于超高靈敏度近紅外ces熒光探針來精確檢測(cè)農(nóng)藥殘留的方法，至關(guān)重要且迫在眉睫。這種熒光探針應(yīng)具備單一激發(fā)波長(zhǎng)、高選擇性、超高靈敏度等特質(zhì)，能夠?qū)ｉT針對(duì)農(nóng)藥殘留展開精確檢測(cè)，同時(shí)便于在生物體內(nèi)加以應(yīng)用，從而構(gòu)建出創(chuàng)新的近紅外熒光探針體系。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明旨在提供一種用于快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留的方法、試劑及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的檢測(cè)農(nóng)藥殘留的方法，能夠達(dá)成對(duì)農(nóng)藥殘留的快速、靈敏且具特異性的檢測(cè)。此外，本發(fā)明所提供的熒光探針不僅可以應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，還可應(yīng)用于羧酸酯酶的檢測(cè)，同時(shí)還能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞熒光成像，能夠?qū)?xì)胞中羧酸酯酶的變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)熒光檢測(cè)，并且能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的有效區(qū)分。

2、具體而言，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)樣品中農(nóng)藥殘留的存在或測(cè)定樣品中的農(nóng)藥殘留含量的方法，所述方法包括如下步驟：

3、a)使羧酸酯酶溶液與樣品接觸形成混合溶液；

4、b)使式(ι)化合物與混合溶液接觸以形成熒光變化的產(chǎn)物；

5、其中，所述式(ι)化合物結(jié)構(gòu)式如下：

6、

7、c)測(cè)定熒光變化的產(chǎn)物的熒光性質(zhì)。

8、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述測(cè)定所述熒光物質(zhì)的熒光性質(zhì)的具體步驟包括：使用熒光光譜儀測(cè)試熒光變化的產(chǎn)物的熒光發(fā)生光譜。

9、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述用于檢測(cè)樣品中農(nóng)藥殘留的存在或測(cè)定樣品中的農(nóng)藥殘留含量的方法，還包括判定樣品中的農(nóng)藥殘留含量的方法，所述判定樣品中的農(nóng)藥殘留含量的方法根據(jù)如下方式判定：

10、根據(jù)一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的農(nóng)藥的濃度與式(ι)化合物溶液反應(yīng)后溶液的熒光強(qiáng)度值的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，利用所述熒光強(qiáng)度值計(jì)算樣品中農(nóng)藥殘留的含量；

11、其中，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制，具體包括如下步驟：

12、配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的農(nóng)藥溶液，先將不同濃度的農(nóng)藥溶液分別與定量且足量的羧酸酯酶溶液混合反應(yīng)，然后分別加入所述式(ι)化合物溶液進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)得反應(yīng)后溶液的熒光發(fā)射光譜，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；

13、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述樣品或農(nóng)藥溶液與羧酸酯酶溶液接觸的時(shí)間為20-60分鐘。

14、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述式(ι)化合物與羧酸酯酶溶液或羧酸酯酶與農(nóng)藥或樣品的混合溶液接觸的時(shí)間為40-60分鐘。

15、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，具體檢測(cè)步驟如下：

16、s1.配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的農(nóng)藥溶液，分別加入到已知濃度的足量且定量的羧酸酯酶溶液中，混合均勻，然后靜置反應(yīng)20-60分鐘；然后再分別加入所述式(ι)化合物溶液，混合均勻，然后靜置反應(yīng)40-60分鐘后使用熒光光譜儀測(cè)試反應(yīng)后溶液的熒光發(fā)射光譜，構(gòu)建熒光光譜在612nm處的熒光強(qiáng)度與相應(yīng)的農(nóng)藥濃度之間的線性關(guān)系，從而獲得檢測(cè)農(nóng)藥殘留濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；

17、s2.將樣品加入已知濃度的足量的羧酸酯酶溶液中，混合均勻，然后靜置反應(yīng)20-60分鐘；然后再分別加入所述式(ι)化合物溶液，混合均勻，然后靜置反應(yīng)40-60分鐘后使用熒光光譜儀測(cè)試反應(yīng)后溶液的熒光發(fā)射光譜，根據(jù)612nm處的熒光強(qiáng)度值和所述標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到檢測(cè)樣品中的農(nóng)藥殘留含量。

18、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述樣品是環(huán)境樣品、化學(xué)樣品、食品樣品或生物樣品。

19、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述樣品是包括水、血液、微生物或者動(dòng)物細(xì)胞在內(nèi)的生物樣品。

20、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述環(huán)境樣品是水環(huán)境樣品。

21、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述樣品是食品樣品。

22、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述靜置反應(yīng)的反應(yīng)體系均為ph＝7.4的pbs緩沖溶液體系(含有1％?dmso)。

23、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述靜置反應(yīng)的反應(yīng)體系均為ph＝7.4的pbs緩沖溶液體系(10mm?pbs，含有1％?dmso)。

24、本發(fā)明還提供了一種熒光探針，具有如式(ι)所示結(jié)構(gòu)：

25、

26、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述熒光探針可以用于檢測(cè)樣品中農(nóng)藥殘留的存在或測(cè)定樣品中的農(nóng)藥殘留含量。

27、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述熒光探針可以用于檢測(cè)樣品中羧酸酯酶的存在或測(cè)定樣品中的羧酸酯酶含量。

28、本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)樣品中農(nóng)藥殘留的存在或測(cè)定樣品中的農(nóng)藥殘留含量的試劑、試劑盒或組合物，包含式(ι)化合物，其中所述式(ι)化合物結(jié)構(gòu)式如下：

29、

30、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述用于檢測(cè)樣品中農(nóng)藥殘留的存在或測(cè)定樣品中的農(nóng)藥殘留含量的試劑盒或組合物進(jìn)一步包含溶劑、酸、堿、緩沖溶液或其組合。

31、本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)樣品中羧酸酯酶的存在或測(cè)定樣品中的羧酸酯酶含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

32、1)使式(ι)化合物與樣品接觸以形成熒光變化的產(chǎn)物；

33、其中，所述式(ι)化合物結(jié)構(gòu)式如下：

34、

35、2)測(cè)定熒光變化的產(chǎn)物的熒光性質(zhì)。

36、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述測(cè)定所述熒光物質(zhì)的熒光性質(zhì)的具體步驟包括：使用熒光光譜儀測(cè)試熒光變化的產(chǎn)物的熒光發(fā)生光譜。

37、本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)樣品中羧酸酯酶的存在或測(cè)定樣品中的羧酸酯酶含量的試劑、試劑盒或組合物，包含式(ι)化合物，其中所述式(ι)化合物結(jié)構(gòu)式如下：

38、

39、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述用于檢測(cè)樣品中羧酸酯酶的存在或測(cè)定樣品中的羧酸酯酶含量的試劑盒或組合物進(jìn)一步包含溶劑、酸、堿、緩沖溶液或其組合。

40、本發(fā)明還提供了式(ι)化合物在在以下方面的應(yīng)用：

41、①制備檢測(cè)樣品中農(nóng)藥殘留的存在或測(cè)定樣品中的農(nóng)藥殘留含量的試劑或試劑盒；

42、②檢測(cè)樣品中農(nóng)藥殘留的存在或測(cè)定樣品中的農(nóng)藥殘留含量；

43、③制備檢測(cè)樣品中羧酸酯酶的存在或測(cè)定樣品中的羧酸酯酶含量的試劑或試劑盒；

44、④檢測(cè)樣品中羧酸酯酶的存在或測(cè)定樣品中的羧酸酯酶含量；

45、⑤細(xì)胞熒光成像；

46、⑥肝臟病變成像；

47、⑦制備肝臟疾病診斷或監(jiān)測(cè)試劑；

48、其中，所述式(ι)化合物結(jié)構(gòu)式如下：

49、

50、本發(fā)明還提供了式(ⅰ)化合物的制備方法，包括如下步驟：

51、使3-羥基-3-甲基丁-2-酮與丙二腈，反應(yīng)制得式(ⅲ)化合物；使式(ⅲ)化合物與3-氯-4-羥基苯甲醛，反應(yīng)制備得式(ⅱ)化合物；使式(ⅱ)化合物與乙酰氯，反應(yīng)制得式(ⅰ)化合物；其反應(yīng)式如下：

52、

53、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述將式(ⅲ)化合物與3-氯-4-羥基苯甲醛反應(yīng)的溫度為90℃；所述式(ⅱ)化合物與二異丙基乙胺在四氫呋喃中的反應(yīng)環(huán)境為冰水浴，與乙酰氯的反應(yīng)溫度為室溫。

54、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述3-羥基-3-甲基丁-2-酮與丙二腈微波加熱的反應(yīng)時(shí)間為8分鐘，所述式(ⅲ)化合物與3-氯-4-羥基苯甲醛微波反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間為15小時(shí)，式(ⅱ)化合物與對(duì)乙酰氯反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)。

55、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，式(ⅰ)化合物具體制備方法如下：將3-羥基-3-甲基丁-2-酮與丙二腈溶解在無(wú)水乙醇中，并加入乙醇鈉，在密閉環(huán)境下用20瓦的聚焦微波照射8分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，分離出固體并從乙醇中重結(jié)晶，得到式(ⅲ)化合物。將式(ⅲ)化合物與3-氯-4-羥基苯甲醛，溶于無(wú)水乙醇中，加入哌啶，在氬氣保護(hù)下于90℃密封環(huán)境中回流15小時(shí)，冷卻至有暗紅色固體析出，抽濾，濾餅用無(wú)水乙醇洗滌，對(duì)其在60℃環(huán)境下進(jìn)行真空干燥，得到純凈的式(ⅱ)化合物。將式(ⅱ)化合物與二異丙基乙胺溶于四氫呋喃中，在氬氣保護(hù)下于冰水浴中攪拌反應(yīng)，逐滴加入乙酰氯與四氫呋喃的混合溶液，隨后室溫環(huán)境下攪拌反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，向瓶?jī)?nèi)加入飽和氯化銨水溶液混合均勻后靜至分層，水層用乙酸乙酯萃取。合并有機(jī)相，并用飽和食鹽水洗滌，混合均勻后靜至分層，有機(jī)相使用無(wú)水硫酸鈉干燥，再經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到粗產(chǎn)物；再進(jìn)一步通過色譜柱進(jìn)行分離，石油醚和乙酸乙酯的混合體系為洗脫劑，得到純凈的式(ⅰ)化合物。

56、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述3-羥基-3-甲基丁-2-酮與丙二腈的摩爾比為1:2，式(ⅲ)化合物與3-氯-4-羥基苯甲醛的摩爾比為1:1；式(ⅱ)化合物與乙酰氯的摩爾比為1:1。

57、本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的顯著優(yōu)點(diǎn)及效果：

58、(1)雙重檢測(cè)功能

59、本發(fā)明提供的式(ι)化合物既可以下實(shí)現(xiàn)對(duì)羧酸酯酶的檢測(cè)、測(cè)量及篩選，又基于酶抑制原理可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于農(nóng)藥殘留的定性或定量檢測(cè)，這種多功能性使得本發(fā)明提供的式(ι)化合物在科研、農(nóng)業(yè)及食品安全等多個(gè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

60、(2)響應(yīng)穩(wěn)定

61、本發(fā)明提供的式(ι)化合物在與羧酸酯酶發(fā)生特異性響應(yīng)后，該化合物能夠在近紅外光譜區(qū)域內(nèi)維持其熒光強(qiáng)度的長(zhǎng)期穩(wěn)定，有效抵御了外界環(huán)境因素的干擾，這種卓越的穩(wěn)定性確保了檢測(cè)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性，為長(zhǎng)時(shí)間、連續(xù)監(jiān)測(cè)提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

62、(3)選擇性、抗干擾能力強(qiáng)

63、本發(fā)明提供的式(ι)化合物可選擇性的與羧酸酯酶發(fā)生特異性反應(yīng)，生成熒光變化的產(chǎn)物，相較于常見的其他金屬離子及生物體內(nèi)的其他物質(zhì)，包括但不限于鈣離子、鐵離子、亞鐵離子、鈉離子、鉀離子、銅離子、鋅離子、碳酸根離子、亞硝酸根離子、硝酸根離子、乙酸根離子、溴離子、硫酸根離子、碳酸氫根離子、亞硫酸氫根離子、氯離子、硫離子、次氯酸、碘離子、過氧化氫、抗壞血酸鈉、β-半乳糖苷酶、溶菌酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶、谷胱甘肽等，本發(fā)明提供的式(ι)化合物能有效屏蔽了眾多常見干擾物質(zhì)，顯示出了優(yōu)良的選擇性以及抗干擾能力。因此，基于式(ι)化合物的快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留的方法也對(duì)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)顯示出來良好的特異性和較強(qiáng)的抗干擾能力。

64、(4)高靈敏度

65、本發(fā)明提供的式(ι)化合物與羧酸酯酶反應(yīng)極為靈敏，能夠檢測(cè)超低濃度水平下的羧酸酯酶，檢出限為4.41×10-5u/ml；同時(shí)，基于式(ι)化合物的快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留的方法也展現(xiàn)出來對(duì)農(nóng)藥殘留的超靈敏檢測(cè)能力，檢出限為27.5μg/l。

66、(5)低生物毒性

67、本發(fā)明提供的式(ι)化合物具有低毒性的特點(diǎn)，可將其長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用于細(xì)胞樣品中羧酸酯酶或農(nóng)藥殘留的檢測(cè)及熒光成像。

68、(6)可在生理水平下應(yīng)用

69、本發(fā)明提供的式(ι)化合物可在生理水平條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)羧酸酯酶的檢測(cè)、測(cè)量及篩選，并可以進(jìn)行細(xì)胞生物成像，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)羧酸酯酶變化的熒光信號(hào)響應(yīng)及其實(shí)時(shí)可視化檢測(cè)，同時(shí)也為檢測(cè)肝癌早期的羧酸酯酶變化提供了可能。

70、(6)可實(shí)現(xiàn)區(qū)分肝癌細(xì)胞

71、本發(fā)明提供的式(ι)化合物可檢測(cè)肝臟細(xì)胞中的羧酸酯酶活性變化，根據(jù)這一特性，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)肝臟正常細(xì)胞以及肝癌細(xì)胞的區(qū)分，為檢測(cè)肝癌早期提供了新的工具和方法。

72、(7)應(yīng)用于檢測(cè)肝臟損傷

73、本發(fā)明提供的式(ι)化合物可作為一種非侵入性的工具，可以用于監(jiān)測(cè)肝臟損傷中羧酸酯酶的變化，為早期肝癌的發(fā)生和發(fā)展提供了方法和工具。這種應(yīng)用前景使得本發(fā)明在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域具有巨大潛力，有望提高肝癌的早期診斷率和治療效果。

74、(8)合成簡(jiǎn)單

75、本發(fā)明的提供的式(ι)化合物合成簡(jiǎn)單，有利于降低檢測(cè)農(nóng)藥殘留和羧酸酯酶的成本，有利于商業(yè)化及產(chǎn)業(yè)化的推廣和應(yīng)用。