本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，尤其涉及l(fā)-賴氨酸作為生物標(biāo)志物在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid?arthritis，ra)是一種常見的以關(guān)節(jié)組織慢性炎癥為主要特征的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，以病變關(guān)節(jié)處有大量的炎性細(xì)胞浸潤和滑膜組織過度增生為主要病理特點。ra發(fā)生常見于女性，世界范圍內(nèi)影響了約0.5～1％的人口。在我國，ra的發(fā)生率約為0.28％。ra病情進(jìn)展迅速，病變?nèi)菀讓?dǎo)致關(guān)節(jié)功能衰退，發(fā)病1年內(nèi)可能出現(xiàn)輕度的功能喪失，2年內(nèi)往往有關(guān)節(jié)間隙變窄、骨質(zhì)破壞、囊性變等臨床癥狀發(fā)生，造成不可逆的關(guān)節(jié)骨損傷，最終導(dǎo)致畸形，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。ra發(fā)病機制復(fù)雜，目前的研究成果尚不能完全闡明其發(fā)病機制，現(xiàn)有的藥物只能通過抑制免疫反應(yīng)緩解疾病進(jìn)展，無法徹底治愈ra。因此早期診斷和及時干預(yù)治療對ra患者的預(yù)后至關(guān)重要。

2、目前ra臨床診斷主要依據(jù)患者臨床癥狀、x線表現(xiàn)及經(jīng)典實驗室指標(biāo)。然而，ra在早期的臨床表征較為多樣，傳統(tǒng)實驗室診斷指標(biāo)在臨床實踐中存在諸多不足，極易出現(xiàn)漏診、誤診現(xiàn)象，從而導(dǎo)致患者錯失最佳治療時機。目前參與ra診斷的傳統(tǒng)實驗室指標(biāo)主要為自身抗體，根據(jù)2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會/歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟(acr/eular)的分類標(biāo)準(zhǔn)，這類自身抗體主要是類風(fēng)濕因子(rheumatoidfactor，rf)和抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(anti-cycliccitrullinatedpeptide?antibodies，anti-ccp)。然而在實際臨床應(yīng)用中，rf和anti-ccp存在相當(dāng)?shù)木窒扌浴０凑?010年acr/eular標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)ra患者血清學(xué)指標(biāo)rf和anti-ccp呈現(xiàn)陰性時，病變需要影響超過10個關(guān)節(jié)才能被診斷為ra。因此，尋找新的診斷標(biāo)志物來提高anti-ccp和rf的診斷效能對ra患者，尤其是對清學(xué)指標(biāo)(rf和anti-ccp)陰性的ra患者具有重要意義。

3、我們前期通過非靶向代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)l-賴氨酸在ra患者的血清中濃度降低，具有較好的診斷ra的作用。賴氨酸為人類的必需氨基酸之一，只有l(wèi)型可被生物體吸收。賴氨酸在促進(jìn)人體生長發(fā)育、增強免疫力和促進(jìn)脂肪氧化發(fā)揮重要作用。然而，關(guān)于l-賴氨酸在ra診斷中的作用還知之甚少。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種定量檢測l-賴氨酸的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法，及其在ra診斷中的應(yīng)用。本發(fā)明通過使用agilent?1290?infinity?ii?series超高效液相色譜儀和裝備ajs-esi離子源的agilent?6460三重四極桿質(zhì)譜儀，研發(fā)出一種定量檢測l-賴氨酸的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法，且通過該方法發(fā)現(xiàn)，l-賴氨酸在ra患者中的濃度降低(p<0.0001)，同時受試者工作曲線分析(roc)顯示，auc曲線下面積為0.93，說明l-賴氨酸在ra中具有較好的診斷價值。所以本發(fā)明對于ra患者的臨床診斷，尤其是對血清學(xué)指標(biāo)為陰性的ra患者的臨床診斷，意義重大。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種l-賴氨酸的檢測方法和/或檢測產(chǎn)品在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷產(chǎn)品制備中的應(yīng)用。

4、進(jìn)一步的，通過使用所述檢測方法和/或檢測產(chǎn)品發(fā)現(xiàn)，l-賴氨酸在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中濃度降低。

5、進(jìn)一步的，所述檢測方法包括高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，所述檢測產(chǎn)品包括使用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對l-賴氨酸進(jìn)行檢測時所使用的儀器和/或試劑。

6、進(jìn)一步的，所述高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法方法包括以下步驟：

7、(1)樣本前處理；

8、(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制；

9、(3)樣本檢測，其中包括使用agilent?1290?infinity?ii?series超高效液相色譜儀和裝備ajs-esi離子源的agilent?6460三重四極桿質(zhì)譜儀；

10、(4)校準(zhǔn)曲線繪制；

11、(5)樣本中目標(biāo)代謝物濃度計算。

12、進(jìn)一步的，所述樣本源自于血漿。

13、進(jìn)一步的，所述樣本前處理包括提取液提取步驟，所述提取液中甲醇：乙腈＝1：1，-40℃預(yù)冷。

14、進(jìn)一步的，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液配置完成得一系列校準(zhǔn)溶液，其中l(wèi)-賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度依次為100000，50000，25000，12500，6250，3125，1562.5，781.25，390.63，195.31，97.66，48.83，24.41，12.21，6.10，3.05?nmol/l。

15、進(jìn)一步的，所述樣本檢測時的高效液相色譜條件為：選用waters?acquity?uplcbehamide液相色譜柱，100×2.1?mm，1.7μm，waters，a相為10?mm甲酸銨&0.1％甲酸水溶液，b相為乙腈，柱溫箱溫度為35℃，樣品盤設(shè)為4℃，進(jìn)樣體積為1μl，流動相梯度洗脫程序如下所示：

16、 time a b flow 0.00min 17.00％ 83.00％ 0.350ml/min 1.00min 17.00％ 83.00％ 0.350ml/min 3.00min 50.00％ 50.00％ 0.350ml/min 4.00min 50.00％ 50.00％ 0.350ml/min 4.50min 17.00％ 83.00％ 0.350ml/min 9.00min 17.00％ 83.00％ 0.350ml/min

17、。

18、進(jìn)一步的，所述樣本檢測時的離子源參數(shù)為：capillary?voltage＝+4000/-3500v，nozzlevoltage＝+500/-500?v，n2?gas?temperature＝300℃，n2?gas?flow＝5?l/min，n2?sheath?gastemperature＝250℃，sheath?gas?flow＝11?l/min，nebulizer＝45?psi。

19、本發(fā)明還提供了一種類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括所述應(yīng)用中的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷產(chǎn)品。

20、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下技術(shù)效果：

21、本發(fā)明通過使用agilent?1290?infinity?ii?series超高效液相色譜儀和裝備ajs-esi離子源的agilent?6460三重四極桿質(zhì)譜儀，研發(fā)出一種定量檢測l-賴氨酸的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法，且通過該方法發(fā)現(xiàn)，l-賴氨酸在ra患者中的濃度降低(p<0.0001)，同時受試者工作曲線分析(roc)顯示，auc曲線下面積為0.93，說明l-賴氨酸在ra中具有較好的診斷價值。所以本發(fā)明對于ra患者的臨床診斷，尤其是對血清學(xué)指標(biāo)為陰性的ra患者的臨床診斷，意義重大。