本發(fā)明屬于醫(yī)療領(lǐng)域，更具體的說是涉及一種基于質(zhì)譜流式技術(shù)的單細(xì)胞免疫圖譜的肺結(jié)節(jié)良惡性鑒別診斷模型的建立方法。

背景技術(shù)：

1、肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。絕大部分患者(48％)在初診斷時(shí)就已經(jīng)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這些患者的5年相對生存率僅8％左右，而初診斷為早期肺癌的患者5年生存率可達(dá)62％，但其檢出率僅在20％左右。相比之下，對于i期癌癥，5年生存率顯著增加，從68％到92％。毫無疑問，在可治愈階段(0、i和ii期)增加肺癌檢出率是降低肺癌死亡率的最有效方法。提高肺癌的早期診斷率，對降低肺癌死亡率、改善肺癌預(yù)后至關(guān)重要。

2、然而，由于缺乏臨床癥狀和敏感的技術(shù)，很難在這些早期階段發(fā)現(xiàn)肺癌。包括美國國家肺癌篩查試驗(yàn)(nlst)和荷蘭-比利時(shí)肺癌篩查試驗(yàn)(nelson)試驗(yàn)在內(nèi)的隨機(jī)對照試驗(yàn)表明，采用低劑量ct(ldct)進(jìn)行篩查可顯著降低肺癌的死亡率，但ldct在提高臨床有效性和成本效益方面仍存在不確定性，尤其以亞實(shí)性結(jié)節(jié)的診斷最為困難且最具挑戰(zhàn)性，且ldct篩查還存在一個(gè)問題，就是大量假陽性結(jié)節(jié)的檢出：高危人群經(jīng)ldct檢出的結(jié)節(jié)中，大部分為良性結(jié)節(jié)。來自美國的一項(xiàng)大規(guī)模nlst研究顯示；雖然在接受ldct檢查的人群中，有24.2％的人發(fā)現(xiàn)了肺結(jié)節(jié)，但在隨訪后，有高達(dá)96.4％的陽性結(jié)節(jié)被診斷為良性(假陽性)；也有其它研究顯示，手術(shù)切除后良性肺結(jié)節(jié)的比例高達(dá)20％，活檢后為38％。多項(xiàng)研究證實(shí)，ldct篩查平均結(jié)節(jié)的檢出率大概是20％，而>90％的結(jié)節(jié)是良性的。過高的假陽性可能導(dǎo)致過度診斷、過度治療、醫(yī)療資源的浪費(fèi)及增加受檢者焦慮心理。

3、基于影像學(xué)特征的mayo模型(最早是1997年梅奧診所針對結(jié)節(jié)范圍在4-30mm的患者依據(jù)其年齡、吸煙史姐結(jié)節(jié)直徑、毛刺征、位置等的mayo臨床肺癌預(yù)測模型)，veteransassociation(va)模型及brock模型等被用于判斷結(jié)節(jié)的性質(zhì)，其曲線下面積(auc)為0.65-0.83，模型準(zhǔn)確率不高，而且是如梅奧臨床肺癌預(yù)測模型是基于西方患者所建立的，不一定適用于中國患者，實(shí)際應(yīng)用仍存在一定的局限性。

4、因此，有效地對肺結(jié)節(jié)進(jìn)一步鑒別分流診斷，快速明確其良惡性，盡早切除惡性結(jié)節(jié)，同時(shí)避免不必要的過度治療，減少手術(shù)切除的良性結(jié)節(jié)的比例，是肺部結(jié)節(jié)診斷治療的關(guān)鍵。對于未被滿足的巨大臨床需求，亟需高敏感性和高特異性的方法來準(zhǔn)確識別惡性肺結(jié)節(jié)。

5、另一方面，世界衛(wèi)生組織(who)肺部腫瘤分類(第5版，2021)將不典型腺瘤樣增生(aah)及原位腺癌(ais)歸類為腺體前驅(qū)病變，不納入肺腺癌范疇，并將微浸潤腺癌(mia)和浸潤性腺癌(ia)歸為兩種浸潤程度不同的肺癌。肺癌研究協(xié)會/美國胸科學(xué)會/歐洲呼吸學(xué)會肺腺癌多學(xué)科分類表明mia往往不會擴(kuò)散到區(qū)域淋巴結(jié)或轉(zhuǎn)移，其術(shù)后無病生存率幾乎為100％，故而mia可選擇亞肺葉切除術(shù)且不需要系統(tǒng)淋巴結(jié)清掃，而ia患者的手術(shù)方式需結(jié)合臨床。因此，需要一種在術(shù)前就能有效區(qū)分mia和ia的方法以提前制定手術(shù)方案。

6、人體免疫系統(tǒng)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，腫瘤免疫微環(huán)境(tme)也在不斷變化。腫瘤的免疫改變不僅僅局限于腫瘤內(nèi)，也常伴隨著全身性免疫紊亂，這些發(fā)現(xiàn)突出了腫瘤與外周免疫之間復(fù)雜的相互作用。研究顯示，肺腫瘤存在多種類型的浸潤性免疫細(xì)胞，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著極為重要的作用。巨噬細(xì)胞和t細(xì)胞群在腫瘤免疫微環(huán)境中有潛在的相互作用，且肺腫瘤也富含其他的髓系成分，包括中性粒細(xì)胞、非經(jīng)典單核細(xì)胞和中間單核細(xì)胞等；同時(shí)有研究顯示，b細(xì)胞的存在跟肺癌患者的保護(hù)性免疫相關(guān)；另有一些臨床研究已經(jīng)表明，高密度的腫瘤浸潤性t細(xì)胞與癌癥患者的中位生存期的增加相關(guān)。因此通過全面細(xì)致的監(jiān)測人體外周免疫狀態(tài)或能為肺結(jié)節(jié)良惡性鑒別提供極大的幫助。

7、近年來，質(zhì)譜流式技術(shù)將傳統(tǒng)流式細(xì)胞分析方法與質(zhì)譜檢測方法相結(jié)合，利用金屬同位素標(biāo)簽替代熒光標(biāo)簽，并利用質(zhì)譜對標(biāo)簽進(jìn)行定量，可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平40多種目標(biāo)蛋白的同時(shí)檢測，且通道間沒有互相干擾，無需復(fù)雜繁瑣的補(bǔ)償計(jì)算，顯著增強(qiáng)了評估復(fù)雜細(xì)胞系統(tǒng)和過程的能力，是多參數(shù)、高通量的單細(xì)胞蛋白檢測技術(shù)平臺。通過檢測多標(biāo)記組合，cytof技術(shù)可區(qū)分出多種細(xì)胞亞群，構(gòu)建健康或疾病狀態(tài)的細(xì)胞圖譜、對細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行全面的分析，高維度得分析人體基礎(chǔ)免疫狀態(tài)，獲得全方位的免疫細(xì)胞構(gòu)成、表型和功能信息。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種基于單細(xì)胞免疫圖譜的肺結(jié)節(jié)良惡性鑒別診斷模型的構(gòu)建方法，是基于質(zhì)譜流式技術(shù)的單細(xì)胞免疫圖譜的肺結(jié)節(jié)良惡性鑒別診斷模型的建立方法。通過用ficoll分離法(ficoll密度梯度離心法)處理外周血樣獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral?blood?mononuclear?cell，pbmc)，并對pbmc進(jìn)行質(zhì)譜流式分析，獲得質(zhì)譜流式分析數(shù)據(jù)集；采用parc聚類算法，根據(jù)標(biāo)記表達(dá)將細(xì)胞劃分為不同的表型，利用每個(gè)細(xì)胞亞組的表達(dá)比例作為建模特征，得到肺結(jié)節(jié)良惡性鑒別診斷模型。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、1.用ficoll分離法處理外周血樣獲得pbmc，將它們懸浮在5ml預(yù)冷的流式細(xì)胞分選(fluorescence-activated?cell?sorting，facs)緩沖液(1×pbs+0.5％bsa)中，然后在4℃下400×g離心5min丟棄上清液，并重懸細(xì)胞沉淀物緩沖液。在質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)(cytof，mass?cytometry)檢測前進(jìn)行pbmc的細(xì)胞計(jì)數(shù)和質(zhì)量評估，以確保計(jì)數(shù)大于3×106，存活率大于85％。

4、2.選擇40種金屬偶聯(lián)抗體作為標(biāo)記細(xì)胞的標(biāo)記物；pbmcs用pbs緩沖液洗滌，然后用0.5mm順鉑染色，用fc受體阻斷細(xì)胞與抗體結(jié)合30min，通過離心去除未結(jié)合的抗體。然后將pbmc固定在200μl的插入溶液中過夜。細(xì)胞在蒸餾水中洗滌和重懸，加入20％?eq珠中，并在質(zhì)譜流式細(xì)胞儀上進(jìn)一步分析。40種金屬偶聯(lián)抗體的標(biāo)記物包括：cd45、cd3、cd56、tcrγ/δ、cd196(ccr6)、cd14、igd、cd123(il-3rα)、cd85j(ilt2)、cd19、cd25(il-2rα)、cd274(pd-l1)、cd278(icos)、cd39、cd27、cd24、cd45ra、cd86、cd28、cd197(ccr7)、cd11c、cd33、cd152(ctla-4)、cd161、cd185(cxcr5)、cd66b、cd183(cxcr3)、cd94、cd57、cd45ro、cd127(il-7rα)、cd279(pd-1)、cd38、cd194(ccr4)、cd20、cd16、hla-dr、cd4、cd8a、cd11b。

5、3.采用parc聚類算法，根據(jù)標(biāo)記表達(dá)將細(xì)胞劃分為不同的表型，利用每個(gè)細(xì)胞亞組的表達(dá)比例作為建模特征，使用隨機(jī)森林算法及10倍交叉驗(yàn)證篩選特征。

6、4.通過隨機(jī)森林法建模，得到肺結(jié)節(jié)良惡性鑒別診斷模型。

7、可選的，還包括步驟3篩選出34個(gè)免疫細(xì)胞亞群和標(biāo)記物作為建模特征。肺結(jié)節(jié)良惡性鑒別診斷模型的19的特征包括：cd33-cd14-cd3+cd4+cd28+，cd33-cd14-cd3+cd4+cd274+，cd33-cd14-cd3+cd4+cd197+cd45ra-，cd33-cd14-cd3+cd4+hla_dr+cd38+，cd33-cd14-cd3+cd4+cxcr5-cd183-ccr6-，cd33-cd14-cd3+cd4+cd25+cd127-cd161-cd45ra+，cd33-cd14-cd3+cd8+cd197+-cd45ra+，cd33-cd14-cd3-cd19+cd24+cd38+，cd33-cd14-cd3-cd20-cd38+cd27+，cd33-cd14-cd3-cd56+cd16+cd94+，cd33-cd14-cd3-cd56+cd16+cd161+，cd3-cd19-cd56-cd14-cd123+cd11c+，cd33-cd14-cd3-cd56+cd16-，cd86，cd11c，cd183，cd94，cd4，cd11b；肺癌浸潤程度判斷模型的15個(gè)特征包括：cd33-cd14-cd3+cd8+cd85j+，cd33-cd14-cd3+cd8+cd161-，cd33-cd14-cd3+cd4+，cd33-cd14-cd3+cd4+cd197-cd45ra+，cd33-cd14-cd3+cd4+hla_dr+cd38+，cd33-cd14-cd3+cd4+hla_dr+cd38-?，?cd33-cd14-cd3+cd8+?，cd33-cd14-cd3+cxcr5+?，?cd33-cd14-cd3+cd8+cd197+cd45ra-?，cd33-cd14-cd3-cd19+cd24+cd38+?，?cd33-cd14-cd3-cd56+cd16+?，cd33-cd14-cd3-cd56+cd16+cd57+，cd33-cd14-cd3-cd56+cd16+hla_dr+，cd3-cd19-cd56-cd14-hla_dr-，cd56。

8、可選的，還包括步驟3采用訓(xùn)練集和驗(yàn)證集，是將樣本按入組的時(shí)間順序分為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集。

9、可選的，還包括步驟2采用了40種抗體標(biāo)記物的組合。

10、可選的，在步驟1選擇樣本入組時(shí)，采用隨機(jī)入組，涵蓋了不同結(jié)節(jié)大小(如≤10mm、11-20mm、21-30mm等)、不同類型結(jié)節(jié)(如實(shí)性結(jié)節(jié)、部分實(shí)性結(jié)節(jié)、純磨玻璃密度結(jié)節(jié))、腺癌浸潤程度不同類型的樣本(如不典型腺瘤樣增生aah、原位癌ais、微浸潤腺癌mia、浸潤型腺癌ia等)。

11、經(jīng)由上述的技術(shù)方案可知，本發(fā)明公開提供了一種單細(xì)胞免疫圖譜的肺結(jié)節(jié)良惡性鑒別診斷模型的建立方法，肺癌(病理確認(rèn)的ca)和非癌組樣本(包括影像確認(rèn)的non-ca、病理確認(rèn)的non-ca)區(qū)分診斷中擁有良好的檢測效能，訓(xùn)練集和驗(yàn)證集auc可達(dá)0.95、0.96，優(yōu)于現(xiàn)有的臨床使用的模型：mayo模型(訓(xùn)練集和驗(yàn)證集auc分別為0.75、0.70)，veteransassociation(va)模型(訓(xùn)練集和驗(yàn)證集auc分別為0.73、0.65)及brock模型(訓(xùn)練集和驗(yàn)證集auc分別為0.84、0.85)；而且在最難鑒別的病理非癌組和肺癌組中同樣表現(xiàn)優(yōu)越，訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的auc分別為0.92、0.90，明顯優(yōu)于現(xiàn)有臨床使用模型：mayo模型(訓(xùn)練集和驗(yàn)證集auc分別為0.69、0.61)，veterans?association(va)模型(訓(xùn)練集和驗(yàn)證集auc分別為0.68、0.61)及brock模型(訓(xùn)練集和驗(yàn)證集auc分別為0.72、0.65)。

12、同時(shí)，本方案建立的在術(shù)前就能有效區(qū)分mia和ia的模型方案，訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的auc分別為0.97、0.93。本發(fā)明模型提高了肺癌篩查的敏感性和特異性，降低了漏診和誤診的風(fēng)險(xiǎn)，可用于肺癌輔助診斷及篩查

13、本發(fā)明提供了一種基于質(zhì)譜流式技術(shù)的細(xì)胞免疫圖譜分析的肺癌篩查技術(shù)，通過檢測患者外周血中腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞的表達(dá)譜，分類外周血樣本數(shù)據(jù)，結(jié)合人工智能算法，構(gòu)建學(xué)習(xí)模型，將外周血樣本數(shù)據(jù)輸入該模型中，得到患者為肺癌的風(fēng)險(xiǎn)評分，實(shí)現(xiàn)了肺癌的篩查和早期診斷。該技術(shù)具有非侵入性和高靈敏度、高特異性的特點(diǎn)，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測外周血中肺癌相關(guān)免疫細(xì)胞的表達(dá)譜，提高了肺癌篩查的診斷準(zhǔn)確性，為患者提供了更早的治療機(jī)會和最佳的治療方式。

14、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：(1)提高了肺癌篩查的敏感性和特異性，降低了漏診和誤診的風(fēng)險(xiǎn)；(2)避免有創(chuàng)診斷操作，降低臨床風(fēng)險(xiǎn)；(3)實(shí)現(xiàn)了肺癌的早期診斷，為患者提供了更早的治療機(jī)會；(4)進(jìn)一步對肺癌的浸潤程度進(jìn)行分型，為患者提供更合適的手術(shù)方式；(5)采用了cytof技術(shù)，具有高通量、高分辨率和高靈敏度的特點(diǎn)，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測肺癌相關(guān)免疫細(xì)胞的表達(dá)譜；(6)結(jié)合了人工智能算法，提高了肺癌篩查的準(zhǔn)確性和可靠性。