本發(fā)明屬于白血病檢測領(lǐng)域，特別涉及一種急性淋巴細胞白血病高通量24色流式檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

1、白血病是一類造血干祖細胞的惡性克隆性疾病，因白血病細胞自我更新增強、增殖失控、分化障礙、凋亡受阻，而停滯在細胞發(fā)育的不同階段。白血病細胞大量增生累積，使正常造血受抑制并浸潤其他器官和組織。急性白血病的細胞分化停滯在較早階段，多為原始細胞及早期幼稚細胞，病情發(fā)展迅速。因此，迫切需要提高all的診斷和治療水平來改善患者的生存幾率。而對標準化療方案反應(yīng)差的all患者來說，盡管被分配到高風險組、采用高劑量的化療方案，這些患者的體內(nèi)依然可能殘存少量白血病細胞(mrd)。在all中，mrd的預(yù)后價值和臨床意義最早在1990年代在歐洲和美國的多家中心被提出，這一時期的相關(guān)研究已經(jīng)表明，殘留的白血病細胞水平對于疾病復(fù)發(fā)具有較強的預(yù)測作用，當誘導(dǎo)治療結(jié)束時mrd水平若仍處于陽性水平，復(fù)發(fā)風險顯著增加。mrd細胞對化療藥物常呈現(xiàn)較強的耐受能力，且數(shù)量稀少，長期隱藏在患者體內(nèi)難于檢測，往往在化療之后再次大量增殖，引起疾病復(fù)發(fā)。而復(fù)發(fā)all患者的生存率一般僅不足30％。國際上，通常以萬分之一為界，超過萬分之一的mrd通常意味著更高的癌癥復(fù)發(fā)率。雖然對于mrd的檢測方法存在多樣性，但由于它們的靈敏度有限，真正的mrd陰性實際上難以達到，患者骨髓內(nèi)往往殘留著少量白血病細胞，這些白血病殘留細胞(mrd細胞)通常成為白血病復(fù)發(fā)的根源，因此，通過監(jiān)測mrd水平，可以在評估療效的同時，更早更準確地預(yù)測疾病復(fù)發(fā)，從而在尚未復(fù)發(fā)時或復(fù)發(fā)早期提示采取介入治療手段，以提高患者的存活機率，改善患者的預(yù)后。

2、目前我國臨床mrd監(jiān)測以8-12流式檢測為主，通過檢測細胞表面抗原的表達，監(jiān)測疾病進展中的mrd水平，精準度可以達到10-3～-5。8色流式檢測技術(shù)作為目前臨床mrd檢測的金標準，具有適用范圍廣、速度快等優(yōu)點，臨床上用于評估all的患者的早期治療反應(yīng)和預(yù)后風險評估，其檢測的指標主要包括cd10、cd19、cd20、cd33、cd34、cd38等發(fā)育階段相關(guān)的表面蛋白。cd10是存在于b前體細胞和成熟的中性粒細胞的一種表面蛋白；cd38是一種多功能的跨膜糖蛋白，它本身是胞膜受體，能夠影響b細胞的分化和增殖并在在b前體細胞中表達，然而，大多數(shù)b-all細胞的cd38表達減少。以上檢測指標經(jīng)歷了長期的實驗室以及臨床試驗的探索和優(yōu)化，目前不同研究所所使用的組合仍不完全相同。另外，除了常見的檢測抗原以外，all細胞往往還表達其他重要且復(fù)雜的表面抗原，且在治療過程中all細胞表型往往會發(fā)生變化，骨髓移植后的患者通常幾乎沒有循環(huán)白細胞直至造血植入和重建，目前的流式檢測難以準確評估免疫表型異變和精確檢測骨髓移植后患者的mrd水平，我們通常所說的“白血病相關(guān)免疫表型”(leukemia-associated?immunophenotype,laip)也僅是多個白血病亞克隆的組合。而復(fù)發(fā)難治患者的不良預(yù)后促使我們開發(fā)更加精準的白血病鑒定方法，并有助于及時識別患者的早期復(fù)發(fā)。故目前的流式不足以評判all患者的預(yù)后。

3、白血病分化相關(guān)的表面抗原和胞內(nèi)蛋白的磷酸化水平和患者的預(yù)后具有非常重要的相關(guān)性。國際上已有課題組采用單細胞質(zhì)譜技術(shù)實現(xiàn)了對同一細胞中上述蛋白因子的平行檢測，證明這些“與復(fù)發(fā)相關(guān)的發(fā)育依賴性預(yù)測因子(ddpr)”具有重要的臨床價值，并根據(jù)ddpr建立了急性淋巴細胞白血病復(fù)發(fā)預(yù)測模型，顯著改善了目前已有的風險分層方法。且ddpr鑒定的細胞表型也可為復(fù)發(fā)風險患者提供合理的藥物靶點，對臨床具有重要的指導(dǎo)意義。但單細胞質(zhì)譜檢測(cytof)存在價格昂貴(數(shù)萬元/樣本)、檢測時間長(超過12小時)等諸多問題，不適合臨床應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是all細胞往往表達大量重要且復(fù)雜的表面抗原，且在治療過程中all細胞表型往往會發(fā)生變化，8色流式不足以準確評估免疫表型異變和骨髓移植后患者的mrd水平，本發(fā)明可以同時檢測同一細胞的24種表面和胞內(nèi)抗原，不僅可以顯著提高mrd檢測精準度，并通過將all細胞分為12個發(fā)育階段。研究白血病細胞的發(fā)育階段具有意義，主要在于其耐藥性往往與發(fā)育階段具有密切關(guān)系。許多研究表明，相對于成人all患者，兒童all患者具有更好的治療反應(yīng)和更長的無病生存期。其中一個可能的解釋是兒童all患者體內(nèi)的腫瘤細胞通常處于較早的發(fā)育階段，比如前b細胞或者t細胞，這些細胞對化療藥物的敏感性更高。相比之下，成人all患者通常具有更成熟的b細胞表型，因而腫瘤細胞可能已經(jīng)發(fā)育到對化療藥物的耐藥性較高的階段。因此，針對24種抗原的檢測可以更精確識別初診時的免疫分型，以及骨髓移植后和car-t細胞治療后的免疫表型異變，這對患者的預(yù)后評估有非常重要的指導(dǎo)意義。此外，本發(fā)明納入了國際上已被驗證的與白血病預(yù)后相關(guān)的白血病分化相關(guān)的表面抗原和胞內(nèi)蛋白的磷酸化水平相關(guān)抗原，這對于患者的預(yù)后風險分層和藥物靶點選擇具有重要的指導(dǎo)意義。

2、在第一方面，本發(fā)明提供了一種急性淋巴細胞白血病高通量24色流式檢測試劑盒，所述試劑盒基于流式細胞術(shù)進行檢測，其組成包括細胞懸液處理液、細胞膜表面抗原的抗體預(yù)混液、固化處理液和細胞內(nèi)抗原的抗體預(yù)混液；其中，所述細胞膜表面抗原的抗體預(yù)混液包括：抗cd19抗體、抗cd10抗體、抗cd73抗體、抗cd58抗體、抗ighs抗體、抗cd45rb抗體、抗cd95抗體、抗cd24抗體、抗cd33抗體、抗cd22抗體、抗cd38抗體、抗cd45抗體、抗cd127抗體、抗cd20抗體、抗cd34抗體和抗fvs620抗體。本發(fā)明通過精確的表面抗體比例用量，可以實現(xiàn)信號補償平衡，從而實現(xiàn)24色信號的同時獲取。

3、進一步的，所述細胞懸液處理液包括stain?buffer和brilliant?stain?buffer。

4、進一步的，所述固化處理液包括fix/perm和perm/wash。

5、進一步的，所述細胞內(nèi)抗原的抗體預(yù)混液包括：抗p4ebp1抗體、抗zap70抗體、抗ighi抗體、抗cd179a抗體、抗cd179b抗體、抗tdt抗體、抗ps6抗體和抗pcreb抗體。

6、在第二方面，本發(fā)明提供了一種急性淋巴細胞白血病高通量24色流式檢測試劑盒的使用方法，包括如下步驟：

7、(1)采用stain?buffer和brilliant?stain?buffer處理細胞懸液；

8、(2)利用細胞膜表面抗原的抗體預(yù)混液對步驟(1)的細胞懸液進行染色；

9、(3)采用fix/perm和perm/wash固定和透化懸浮液中的細胞；

10、(4)利用細胞內(nèi)抗原的抗體預(yù)混液對步驟(3)的細胞懸液進行染色；

11、(5)使用流式細胞儀檢測分析。

12、進一步的，所述步驟(1)中是向1x106細胞懸液中加入2ml?stain?buffer洗細胞兩次，加入50μl?brilliant?stain?buffer后再加入細胞膜表面抗原的抗體預(yù)混液。

13、進一步的，所述步驟(3)中向細胞懸液中1ml?fix/perm后4度孵育40-50min，用2mlperm/wash洗細胞2次，加入50μl?perm/wash后再加入細胞內(nèi)抗原的抗體預(yù)混液。

14、進一步的，所述步驟(5)中用facsymphony上機，先圈活性單核細胞，調(diào)節(jié)補償之后進行圈門，可將急性淋巴細胞白血病中異常的b細胞分為12個發(fā)育階段。

15、在第三方面，本發(fā)明提供了根據(jù)第一方面所述的急性淋巴細胞白血病高通量24色流式檢測試劑盒在急性淋巴細胞白血病免疫分型和預(yù)后風險分層中的用途。本發(fā)明提供的24色流式檢測試劑盒可以實現(xiàn)同一細胞中24種表面抗原和胞內(nèi)蛋白的平行檢測，并將急性淋巴細胞白血病中異常的b細胞分為12個發(fā)育階段，在顯著提高mrd檢測精準度的同時更精確識別初診時的免疫分型，以及骨髓移植后和car-t細胞治療后的免疫表型異變，并通過已建立的急性淋巴細胞白血病復(fù)發(fā)預(yù)測模型精確指導(dǎo)急性淋巴細胞白血病的治療與預(yù)后。

16、有益效果

17、①本發(fā)明的24色流式檢測試劑盒可以顯著提高mrd檢測精準度，該技術(shù)所提供的豐富數(shù)據(jù)可以與其他分子生物學技術(shù)(如pcr、二代測序)相結(jié)合，進一步提高all診斷和治療的精準度。通過整合多維度的數(shù)據(jù)，臨床上可以全面了解all患者的疾病特征，制定更加個性化的治療方案。例如，可以結(jié)合基因突變和表面標志物表達數(shù)據(jù)，預(yù)測患者對特定藥物的反應(yīng)，從而選擇最合適的治療方案。此外，24色流式能夠在更低的檢測限度下識別白血病細胞，這對于發(fā)現(xiàn)早期復(fù)發(fā)和評估治療效果非常重要。靈敏的mrd檢測可以對患者及時調(diào)整治療策略，改善患者生存。

18、②本發(fā)明開發(fā)的24色流式檢測試劑盒在原有8色流式的基礎(chǔ)上增加了all細胞表面抗原，通過將all細胞分為12個發(fā)育階段，能更好的評估免疫表型異變和精確檢測骨髓移植后患者的mrd水平，對患者的預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。另外，這種多參數(shù)的分析能力使得檢測平臺能夠更全面地描述all細胞，識別其異質(zhì)性，從而提高診斷的準確性。例如，通過同時檢測多個表面標志物，可以更精準地鑒定和區(qū)分不同的白血病亞型，這對于選擇合適的治療方案至關(guān)重要。

19、③本發(fā)明開發(fā)的24色流式檢測試劑盒，在原有8色流式的基礎(chǔ)上，加上了白血病分化相關(guān)的表面抗原和胞內(nèi)蛋白，可以實現(xiàn)了同一細胞中24種表面抗原和胞內(nèi)蛋白的快速、廉價的平行檢測，由于all是一種高度異質(zhì)性的疾病，不同患者之間的細胞特征可能存在顯著差異。24色流式能夠詳細分析白血病細胞的異質(zhì)性，提供更豐富的細胞表型信息。這有助于揭示不同患者的細胞群體特征，為個體化治療提供依據(jù)。例如，可以識別出對特定治療方案敏感或耐藥的細胞群體，從而優(yōu)化治療方案，提高治療效果。