本發(fā)明屬于腎病診斷藥劑或試劑，具體涉及多組代謝標(biāo)志物在不同病理類型腎病綜合征鑒別診斷方面的應(yīng)用，本技術(shù)提供多組能夠用于診斷不同病理類型腎病綜合征(包括膜性腎病、微小病變)的代謝標(biāo)志物，主要解決現(xiàn)有的診斷手段不能實現(xiàn)原發(fā)性腎病綜合征無創(chuàng)、快速、有效的病理類型鑒別診斷。

背景技術(shù)：

1、腎病綜合征(nephrotic?syndrome，ns)是由多種病因引起，腎小球基底膜通透性增加，表現(xiàn)為大量的蛋白尿(每日＞3.5g/1.73m2體表面積)、低白蛋白血癥(血漿白蛋白＜30g/l)、水腫伴或不伴有高脂血癥的一組臨床癥候群。ns主要分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類，原發(fā)性ns是指病因不明的腎病綜合征。原發(fā)性ns按病理類型主要包括：膜性腎病(membranous?nephropathy，mn)、微小病變(minimal?change?disease，mcd)、iga腎病(iganephropathy，iga)等。成人中，mn和mcd是ns最常見的病理類型。

2、目前，腎臟穿刺活檢是不同病理類型ns鑒別診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。但是，腎臟穿刺術(shù)存在許多弊端：①腎穿刺是一個侵入性的檢查，術(shù)后可能留下創(chuàng)傷，容易加重血尿，嚴(yán)重者可以引發(fā)大出血導(dǎo)致死亡；②獲取的組織較少，如果腎臟病變呈現(xiàn)局灶性或者分布不均，有可能因為出現(xiàn)偏差而導(dǎo)致醫(yī)生誤診；③禁忌癥較多，在臨床實踐中許多患者不適合進行腎活檢。此外，mcd等往往起病比較急，如治療不及時可能對腎功能造成不可逆的損傷，而腎活檢往往一般需要幾天時間才能出結(jié)果可能延誤治療。

3、因此，臨床急需無創(chuàng)、快速、有效的原發(fā)性ns鑒別診斷方法。m型磷脂酶a2受體(pla2r)和1型血小板反應(yīng)蛋白7a域(thsd7a)可用于mn的診斷，且pla2r抗體滴度可反應(yīng)疾病活動及判斷預(yù)后。但是這兩種標(biāo)志物的敏感性和特異性不夠高，研究發(fā)現(xiàn)約70％的mn患者血清中存在針對pla2r的自身抗體，仍有部分mn患者表現(xiàn)為pla2r陰性。而在成人mn中，thsd7a抗體陽性率僅為1.4％～3.1％。因此，仍需進行腎活檢以明確診斷，尤其是對于pla2r陰性的mn。而對于mcd，目前臨床尚缺乏可靠的血液診斷標(biāo)志物。

4、代謝組學(xué)是對生物體內(nèi)所有代謝物進行定量分析并尋找代謝物與生理病理變化的相對關(guān)系的研究方式，是系統(tǒng)生物學(xué)的組成部分，涉及生命科學(xué)、分析科學(xué)以及統(tǒng)計學(xué)等多方面的知識，目前已經(jīng)在很多領(lǐng)域都有極為重要的作用，在新藥研發(fā)、藥物毒理研究和安全性評價、臨床病理生理研究、疾病的早期診斷、個性化治療等眾多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

5、現(xiàn)有技術(shù)中也公開了腎病代謝標(biāo)志物的相關(guān)專利，例如中國專利cn114026427a、cn116840387a。但是專利cn114026427a注重尋找診斷早期慢性腎病ckd(特別是早期糖尿病腎病)的相關(guān)代謝物。而專利cn116840387a雖然研究了尿液代謝標(biāo)志物用于mn和iga腎病兩種腎病綜合征之間的病理分型，但是診斷效能不高，auc最高的標(biāo)志物僅為0.734，無法滿足臨床要求；且僅納入了mn和iga腎病兩種病理類型，臨床實踐中無法排除其他類型腎病綜合征對診斷結(jié)果的干擾。

6、血漿分析是臨床上常用的一種疾病診斷方法，因其簡便、快速、經(jīng)濟且相對無創(chuàng)的優(yōu)點而被廣泛采用。由此可見，為了提高mn和mcd的診斷準(zhǔn)確率，迫切需要研究開發(fā)準(zhǔn)確率更高、靈敏度和特異性更強的標(biāo)志物。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、原發(fā)性ns按病理類型主要包括：膜性腎病(membranous?nephropathy，mn)、微小病變(minimal?change?disease，mcd)、iga腎病(iga?nephropathy，iga)等。成人中，mn和mcd是ns最常見的病理類型。目前，腎臟穿刺活檢是ns不同病理類型的鑒別診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。但是，腎臟穿刺術(shù)存在許多弊端。因此，臨床急需無創(chuàng)、快速、有效的原發(fā)性ns鑒別診斷方法。

2、基于此，本技術(shù)提供多組能夠用于診斷不同病理類型腎病綜合征(包括膜性腎病、微小病變)的代謝標(biāo)志物，主要解決現(xiàn)有的診斷手段不能實現(xiàn)原發(fā)性腎病綜合征無創(chuàng)、快速、有效的病理類型鑒別診斷。

3、為達到上述目的，本發(fā)明創(chuàng)造的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：

4、本發(fā)明首先提供了腎病綜合征鑒別、診斷標(biāo)志物，所述標(biāo)志物包括用于診斷膜性腎病的標(biāo)志物和/或用于診斷微小病變腎病的標(biāo)志物。

5、具體的，所述標(biāo)志物為代謝標(biāo)志物，包括水楊尿酸(salicyluric?acid)、十二烯?；鈮A(decadienoyl-carnitine)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic?acid,dha)、n-乙?；?l-亮氨酸(n-acetyl-l-leucine)、β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-nicotinamide?adeninedinucleotide?hydrate，β-nad)、異維a酸(13-cis-retinoic?acid)、甲萘醌(menadione)、二十二碳一烯酸(fa?22:1)、吲哚-3-丙酸(3-indolepropionic?acid)、乳清酸(oroticacid)、齊墩果酸(oleanolic?acid)、3-吲哚甲醛(indole-3-carboxaldehyde)、二十烷五烯酸乙酯(eicosapentaenoic?acid?ethyl?ester)、甘油-l-脯氨酸(h-gly-pro-oh)、高精氨酸、l-棕櫚酰肉堿、n2-甲基鳥嘌呤、d-苯丙氨酸、4-羥基馬尿酸。

6、具體的，所述用于診斷膜性腎病的標(biāo)志物為水楊尿酸、十二烯?；鈮A、異維a酸(13-cis-retinoic?acid)、甲萘醌(menadione)、乳清酸(orotic?acid)中的一種或兩種以上的標(biāo)志物組合。

7、具體的，所述微小病變腎病的標(biāo)志物為二十二碳六烯酸、水楊尿酸、n-乙酰基-l-亮氨酸、β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸中的一種或兩種以上的標(biāo)志物組合。

8、進一步的，基于一個總的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供了所述腎病綜合征鑒別、診斷標(biāo)志物在制備不同病理類型腎病綜合征鑒別診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。

9、具體為，所述腎病綜合征鑒別、診斷標(biāo)志物在制備膜性腎病綜合征鑒別診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用，或者所述腎病綜合征鑒別、診斷標(biāo)志物在制備微小病變腎病綜合征鑒別診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。

10、具體的，所述產(chǎn)品為試劑、試劑盒、藥劑或生物芯片。

11、進一步優(yōu)選的，當(dāng)所述產(chǎn)品為試劑盒時，所述試劑盒中含有代謝標(biāo)志物水楊尿酸、十二烯?；鈮A、二十二碳六烯酸、n-乙酰基-l-亮氨酸、β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、異維a酸、甲萘醌、二十二碳一烯酸、吲哚-3-丙酸、乳清酸、齊墩果酸、3-吲哚甲醛、二十烷五烯酸乙酯、甘油-l-脯氨酸、高精氨酸、l-棕櫚酰肉堿、n2-甲基鳥嘌呤、d-苯丙氨酸、4-羥基馬尿酸的標(biāo)準(zhǔn)品，還含有內(nèi)標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)品。

12、具體的，所述產(chǎn)品是通過對受試者的樣品進行前處理，并測定、分析樣品中所述腎病綜合征鑒別、診斷標(biāo)志物的水平，將代謝標(biāo)志物與內(nèi)標(biāo)的比值代入二元邏輯回歸方程，即可得到各個樣品的回歸值，與相應(yīng)的cut-off值比較，診斷受試者的腎病類型。

13、具體的，所述樣品為血漿樣品。

14、具體的，本發(fā)明提供了所述腎病綜合征鑒別、診斷標(biāo)志物在制備膜性腎病綜合征鑒別診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。

15、優(yōu)選的，所述標(biāo)志物為水楊尿酸、十二烯酰基肉堿、異維a酸(13-cis-retinoicacid)、甲萘醌(menadione)、乳清酸(orotic?acid)中的一種或兩種以上的標(biāo)志物組合。

16、進一步優(yōu)選的，所述標(biāo)志物為水楊尿酸、十二烯?；鈮A、或兩者的組合。

17、具體的，本發(fā)明提供了所述腎病綜合征鑒別、診斷標(biāo)志物在制備微小病變腎病綜合征鑒別診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。

18、優(yōu)選的，所述標(biāo)志物為二十二碳六烯酸、水楊尿酸、n-乙?；?l-亮氨酸、β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸中的一種或兩種以上的標(biāo)志物組合。

19、進一步優(yōu)選的，所述標(biāo)志物為二十二碳六烯酸、水楊尿酸、n-乙?；?l-亮氨酸和β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸四者的組合。

20、進一步的，基于一個總的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供了篩選所述腎病綜合征鑒別、診斷標(biāo)志物的方法，包括如下步驟：

21、1)采集血漿樣本，進行前處理，然后進行代謝組學(xué)分析，包括使用兩種互補的色譜方法進行代謝物分離，使用質(zhì)譜進行代謝物檢測，得到檢測數(shù)據(jù)；

22、2)使用sciex?os軟件對步驟1)的檢測數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，并進行保留時間校正、峰鑒定和峰積分，計算各目標(biāo)代謝物的峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積的比值作為該代謝物的相對含量，對不同組間代謝物的統(tǒng)計學(xué)差異進行統(tǒng)計分析。

23、3)對步驟2)得到的差異代謝物使用逐步回歸法篩選影響最顯著的差異代謝物作為自變量，以組別作為因變量，建立最佳二元邏輯回歸(logistic)方程，繪制roc曲線；結(jié)合回歸方程和roc曲線，對潛在分型標(biāo)志物的診斷能力進行評估，最終篩選出具有良好準(zhǔn)確性、靈敏度和特異性標(biāo)志物或者標(biāo)志物組合。

24、具體的，步驟1)中，采用用于弱極性和非極性代謝物的反相液相色譜(rplc)和用于親水性和極性代謝物的親水相互作用液相色譜(hilic)進行代謝物分離；采用sciexqtrap6500三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀進行代謝物檢測。

25、具體的，步驟1)中，液相為exionlc?ad超高效液相色譜，柱溫40℃，自動進樣器溫度4℃；流速0.3ml/min，進樣量5μl。

26、具體的，步驟2)中，不同組間代謝物的統(tǒng)計學(xué)差異采用mann-whitney?u-test(twotail)方法進行統(tǒng)計分析，并利用benjamini-hochberg(bh)方法對p值進行fdr矯正；差異代謝物的定義為p值<0.05，差異倍數(shù)(fold?change，fc)≥1.2或≤0.83。

27、具體的，步驟3)中，篩選的判定標(biāo)準(zhǔn)為，auc為0.5時，表示無診斷意義；auc在0.5～0.7時，表示診斷準(zhǔn)確率較低；auc在0.7～0.9時，表示診斷準(zhǔn)確性中等；auc＞0.9時，表示診斷有較高的準(zhǔn)確性。

28、進一步的，本發(fā)明還提供了一種包括所述腎病綜合征鑒別、診斷標(biāo)志物的腎病綜合征鑒別診斷產(chǎn)品。

29、具體的，所述標(biāo)志物為代謝標(biāo)志物。

30、具體的，所述產(chǎn)品用于鑒別診斷不同病理類型的腎病綜合征。

31、具體的，所述產(chǎn)品為試劑、試劑盒、藥劑或生物芯片。

32、具體的，所述產(chǎn)品是通過對受試者的樣品進行前處理，并測定、分析樣品中所述腎病綜合征鑒別、診斷標(biāo)志物的水平，將代謝標(biāo)志物與內(nèi)標(biāo)的比值代入二元邏輯回歸方程，即可得到各個樣品的回歸值，與相應(yīng)的cut-off值比較，診斷受試者的腎病類型。

33、進一步優(yōu)選的，當(dāng)所述產(chǎn)品為試劑盒時，所述試劑盒中含有代謝標(biāo)志物水楊尿酸、十二烯?；鈮A、二十二碳六烯酸、n-乙?；?l-亮氨酸、β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、異維a酸、甲萘醌、二十二碳一烯酸、吲哚-3-丙酸、乳清酸、齊墩果酸、3-吲哚甲醛、二十烷五烯酸乙酯、甘油-l-脯氨酸、高精氨酸、l-棕櫚酰肉堿、n2-甲基鳥嘌呤、d-苯丙氨酸、4-羥基馬尿酸的標(biāo)準(zhǔn)品，還含有內(nèi)標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)品。

34、具體的，所述樣品為血漿樣品。

35、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

36、1、與臨床常用的腎病綜合征病理類型診斷方法腎活檢相比，本發(fā)明中的血漿代謝標(biāo)志物具有副作用小，血液樣本易采集且前處理方法簡單的優(yōu)點，且靈敏度高、特異性強；與現(xiàn)有的mn患者血漿標(biāo)志物m型磷脂酶a2受體(pla2r)和1型血小板反應(yīng)蛋白7a域(thsd7a)相比，本發(fā)明中的代謝標(biāo)志物具有更好的靈敏度和特異性。

37、2、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，二十二碳六烯酸、水楊尿酸、n-乙?；?l-亮氨酸和β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸4種代謝物單獨或聯(lián)合對腎病綜合征中的mcd患者具有較高的診斷效能，診斷準(zhǔn)確率高，彌補了臨床mcd患者尚缺少血漿標(biāo)志物的不足，具有重要的臨床應(yīng)用價值。

38、3、本發(fā)明對從臨床ns患者血漿樣本入手，進行代謝組學(xué)分析，通過使用兩種互補的色譜方法進行代謝物分離，并對檢測數(shù)據(jù)進行處理、分析，再使用逐步回歸法篩選影響最顯著的差異代謝物，結(jié)合回歸方程和roc曲線，最終篩選出具有良好準(zhǔn)確性、靈敏度和特異性的代謝標(biāo)志物或者標(biāo)志物組合。

39、4、本發(fā)明篩選出兩組腎病綜合征鑒別診斷標(biāo)志物，分別為用于腎病綜合征中膜性腎病(mn)鑒別診斷標(biāo)志物、用于腎病綜合征中微小病變(mcd)鑒別診斷標(biāo)志物，兩組標(biāo)志物均具有良好的靈敏度和特異性。

40、5、本發(fā)明所述標(biāo)志物可以用于制備不同病理類型腎病綜合征鑒別診斷產(chǎn)品，通過對受試者的樣品進行前處理，并測定、分析樣品中所述腎病綜合征鑒別、診斷標(biāo)志物的水平，診斷受試者的腎病類型。