本發(fā)明屬分子成像，具體涉及一種拉曼探針及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、大腦微環(huán)境的ph值在調(diào)節(jié)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞死亡、記憶形成以及維持神經(jīng)元電活動和神經(jīng)回路的功能性穩(wěn)態(tài)中具有至關(guān)重要的意義。通常，大腦的細(xì)胞外ph值通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(例如na+/hco3-共轉(zhuǎn)運(yùn)體和cl-/hco3-交換體)以及神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的ph敏感膜蛋白(如酸敏感離子通道asics)的作用，維持在7.2到7.4的范圍內(nèi)。由于膜蛋白如離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)體和atp酶泵對ph的敏感性，即使是0.1到0.2的ph單位的微小波動也可能對神經(jīng)狀態(tài)、膠質(zhì)細(xì)胞功能和神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)產(chǎn)生重大影響。一般來說，微環(huán)境ph的增加會增強(qiáng)神經(jīng)元的興奮性，而酸化則會減弱興奮性。值得注意的是，ph值與神經(jīng)元興奮性之間的關(guān)系并不簡單。具體而言，一些神經(jīng)元(如化學(xué)敏感神經(jīng)元)在酸性條件下表現(xiàn)出更高的興奮性，而其他神經(jīng)元(如海馬神經(jīng)元)可能表現(xiàn)出相反的反應(yīng)。此外，無論是急性還是慢性的大腦細(xì)胞外酸堿平衡的干擾都可能顯著促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如精神分裂癥、腦腫瘤、癲癇和衰老)的發(fā)起和進(jìn)展。鑒于大腦ph與神經(jīng)功能及腦部疾病之間的相關(guān)性，動態(tài)測量體內(nèi)大腦ph的波動對于深入理解腦功能變化和疾病進(jìn)展的機(jī)制至關(guān)重要。

2、目前，已經(jīng)開發(fā)出多種大腦ph檢測技術(shù)，包括電化學(xué)測量、磁共振成像(mri)、磁共振光譜(mrs)和熒光成像。其中，使用微電極進(jìn)行電化學(xué)檢測是檢測大腦ph的最直接方法，具有良好的靈敏度和程序簡便性。然而，剛性電極界面與大腦組織的直接相互作用可能會影響神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞活動，從而影響ph測量的精確性，并帶來顯著的侵入性風(fēng)險(xiǎn)。作為非侵入性替代方法，各種磁共振技術(shù)，包括31p?mrs、1h?mrs和1h?mri，可以提供用于ph測定的定量信息。然而，這些技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)包括采集速度慢、需要專用硬件和線圈設(shè)備以及操作程序復(fù)雜等問題。熒光成像在ph成像方面展示了顯著優(yōu)勢，包括高靈敏度、簡便性和高時(shí)空分辨率。然而，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的選擇性生理屏障——血腦屏障(bbb)——阻礙了許多外源性物質(zhì)，包括藥物和探針，有效進(jìn)入大腦實(shí)質(zhì)。因此，盡管開發(fā)了許多用于ph檢測的熒光探針，但穿越bbb并在病灶處實(shí)現(xiàn)ph特異性光學(xué)成像的挑戰(zhàn)仍然存在。

3、拉曼光譜學(xué)源于入射光與目標(biāo)分子相互作用時(shí)產(chǎn)生的非彈性散射，它直接或間接提供了分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的特定空間分辨率和化學(xué)洞察。作為分子成像或傳感的理想替代方案，拉曼光譜超越了熒光的局限性，例如易于光漂白和自體熒光。此外，拉曼散射固有的低靈敏度可以通過表面增強(qiáng)拉曼散射(sers)提升，甚至在吸附到皺褶金屬表面后達(dá)到單分子檢測水平。重要的是，sers可以通過表面改性精確定制，以提高生物相容性、穿越生理屏障、選擇性靶向特定細(xì)胞甚至細(xì)胞器。然而，sers探針在體內(nèi)使用時(shí)常常遇到非特異性聚集、分布不均和易受工作條件影響的問題，從而導(dǎo)致模糊甚至不準(zhǔn)確的檢測信號。比率法策略提供了一條提高檢測準(zhǔn)確性的有希望的途徑，通過采用信號自校準(zhǔn)方法來實(shí)現(xiàn)。

4、盡管神經(jīng)系統(tǒng)疾病背后的病理機(jī)制多種多樣，包括蛋白質(zhì)聚集、系統(tǒng)性感染、衰老和遺傳突變，但它們的共同特征是慢性神經(jīng)炎癥。自身免疫性神經(jīng)系統(tǒng)疾病(例如多發(fā)性硬化癥)的特點(diǎn)是外周炎癥細(xì)胞的浸潤，而原發(fā)性神經(jīng)退行性疾病(例如阿爾茨海默病和癲癇)通常表現(xiàn)為顯著的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活。在神經(jīng)炎癥的環(huán)境中，隨著酶活性的增加，尤其是nadph氧化酶的活性增加，導(dǎo)致線粒體功能障礙加劇并增加了活性氧(ros)的產(chǎn)生。這導(dǎo)致氧化損傷并因此放大了炎癥反應(yīng)。同時(shí)，神經(jīng)炎癥刺激了包括細(xì)胞因子、趨化因子、補(bǔ)體成分和自由基在內(nèi)的促炎介質(zhì)的合成和釋放，最終導(dǎo)致大腦功能受損和結(jié)構(gòu)改變。研究表明過氧化氫(h2o2)在神經(jīng)炎癥的環(huán)境中上調(diào)。

5、據(jù)此，構(gòu)建能跨血腦屏障并由h2o2開啟的比率型sers探針，用于特異性成像大腦疾病環(huán)境中的ph波動，是深入理解腦功能變化和疾病進(jìn)展機(jī)制的重要技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的在于提供一種具有串聯(lián)雙比率響應(yīng)、比值信號高、穩(wěn)定性好、入腦效率高、靈敏度高、生物安全性好的自比率型sers探針及其制備方法和應(yīng)用，解決現(xiàn)有的成像腦部ph，特別是特異性成像大腦疾病環(huán)境中ph波動技術(shù)侵入性強(qiáng)、操作速度慢、設(shè)備程序復(fù)雜、血腦屏障透過障礙等技術(shù)問題，以利于大腦疾病環(huán)境中ph波動的準(zhǔn)確監(jiān)測。

2、本發(fā)明提供的串聯(lián)比率響應(yīng)拉曼探針，是由金納米基底、染料分子和多聚物組成的物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)下式v所示：

3、

4、其中，a為金納米基底；

5、x1的結(jié)構(gòu)如式ia所示：

6、

7、其中，s與所述a表面的金通過金硫鍵連接，r1和r2獨(dú)立地為氫、鹵素、c1～c4的烷基、磺酸基或硝基；r1和r2相同或不同。

8、x2為l1-l2，l1為通過金硫鍵與所述a表面的金連接的基團(tuán)，l2為親水性高分子基團(tuán)，中間-表示兩者連接，下同；

9、x3為l1-l3-l4，l1為通過金硫鍵與所述a表面的金連接的基團(tuán)，l3為親水性高分子基團(tuán)，l4為靶向基團(tuán)。

10、a作為拉曼信號增強(qiáng)的基底，用于提供電磁場熱點(diǎn)以增強(qiáng)拉曼報(bào)告分子x1的拉曼信號，提高檢測的靈敏度；x1為具有h2o2和ph雙比率響應(yīng)性的反應(yīng)分子，用于提供目標(biāo)標(biāo)志物的定量依據(jù)；x2用于增加探針的生物相容性；x3賦予探針靶向高效跨血腦屏障的性能。

11、所述a為本領(lǐng)域常規(guī)的金納米基底，a的形狀優(yōu)選為多分支星型狀、多邊形狀、棒狀或球狀，進(jìn)一步優(yōu)選為多分支星型狀或多邊形狀，更優(yōu)選為多分支星型狀。

12、所述a的粒徑為5nm～200nm，優(yōu)選粒徑為10nm～100nm，更優(yōu)選為50±20nm。

13、所述a采用如下方法制備獲得：在溶劑中，將氯金酸、金種子、硝酸銀和抗壞血酸反應(yīng)，而后形成金硫鍵得到a。

14、所述如式v所示的物質(zhì)中：

15、x1與a的摩爾比為1×104:1～5×104:1，優(yōu)選為1×104:1～3×104:1，更優(yōu)選為2×104:1。

16、x2與a的摩爾比為5×104:1～50×104:1，優(yōu)選為10×104:1～40×104:1，更優(yōu)選為15×104:1。

17、x3與a的摩爾比為1×106:1～3×106:1，優(yōu)選為1.5×106:1～3.5×106:1，更優(yōu)選為2×106:1。

18、進(jìn)一步地：

19、所述鹵素為cl、br或i；

20、所述c1～c4的烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基，優(yōu)選為甲基。

21、所述x2的結(jié)構(gòu)中：

22、所述l1的結(jié)構(gòu)為：

23、

24、所述l2為聚乙二醇基團(tuán)、聚乙二醇衍生物基團(tuán)、聚賴氨酸基團(tuán)或聚乙烯亞胺基團(tuán)；優(yōu)選為聚乙二醇衍生物基團(tuán)。

25、所述l2的分子量為1000～10000，優(yōu)選為4000～6000，更優(yōu)選為5000。

26、所述l2為聚乙二醇基團(tuán)，其結(jié)構(gòu)為：

27、

28、所述x2結(jié)構(gòu)為l1-l2，當(dāng)l2為聚乙二醇基團(tuán)時(shí)，x2結(jié)構(gòu)為：

29、

30、所述l3為馬來酰亞胺基團(tuán)修飾的聚乙二醇基團(tuán)、馬來酰亞胺基團(tuán)修飾的聚乙二醇衍生物基團(tuán)、馬來酰亞胺基團(tuán)修飾的聚賴氨酸基團(tuán)或馬來酰亞胺基團(tuán)修飾的聚乙烯亞胺基團(tuán)，優(yōu)選為馬來酰亞胺基團(tuán)修飾的聚乙二醇衍生物基團(tuán)。

31、所述l3的分子量為1000～10000，優(yōu)選為4000～6000，更優(yōu)選為5000。

32、所述l3為馬來酰亞胺基團(tuán)修飾的聚乙二醇基團(tuán)，其結(jié)構(gòu)為：

33、

34、所述l4為跨血腦屏障的靶向基團(tuán)，優(yōu)選為靶向神經(jīng)炎性相關(guān)受體基團(tuán)，更優(yōu)選為晚期糖基化終產(chǎn)物受體(rage)靶向肽、抗vcam-1抗體基團(tuán)或抗il-1β抗體基團(tuán)，特別優(yōu)選為rage靶向肽。

35、所述l4為rage靶向肽，其氨基酸序列為：celkvlmekel。

36、x3為l1-l3-l4，當(dāng)l3為聚乙二醇基團(tuán)、l4?rage靶向肽時(shí)，x3結(jié)構(gòu)式為：

37、

38、進(jìn)一步地：

39、式v所示物質(zhì)的水合粒徑可為110±30nm。

40、式v所示物質(zhì)的表面電荷可為9±5mv。

41、式v所示物質(zhì)可具有拉曼效應(yīng)。

42、式v所示物質(zhì)形成的拉曼譜圖具有以下一個(gè)或多個(gè)特征峰，303cm-1、482cm-1、520cm-1、552cm-1、590cm-1、928cm-1、790cm-1、1169cm-1和1430cm-1處的特征峰。

43、式v所示物質(zhì)形成的拉曼譜圖的特征峰為303cm-1、482cm-1、520cm-1、552cm-1、590cm-1、928cm-1、790cm-1、1169cm-1和1430cm-1處的特征峰。

44、式v所示物質(zhì)形成的拉曼譜圖的特征峰為482cm-1、590cm-1和928cm-1處的特征峰。

45、式v所示物質(zhì)，可用作探針。

46、式v所示物質(zhì)，可用于檢測活性氧，所述活性氧可為超氧陰離子、過氧化氫、單線態(tài)氧、羥基自由基、脂質(zhì)過氧化自由基、臭氧、次氯酸根或次溴酸根，特別為過氧化氫。

47、所述活性氧的濃度可為5μmol/l～100μmol/l。

48、式v所示物質(zhì)，可用于檢測活性氧環(huán)境下的ph。ph的范圍可為2.0～10.0。

49、式v所示的物質(zhì)，可用于檢測器官、組織或細(xì)胞，例如腦組織或神經(jīng)元細(xì)胞。

50、式v所示的物質(zhì)，可用于檢測含有活性氧的器官、組織或細(xì)胞，及其ph，所述含有活性氧的器官、組織或細(xì)胞可為神經(jīng)元細(xì)胞或腦組織(例如致癇灶)。

51、本發(fā)明還提供式v所示物質(zhì)的制備方法，包括如下步驟，在溶劑中，將金納米基底a、ia所示的物質(zhì)x1、聚合物x2和聚合物x3反應(yīng)，得到物質(zhì)v。

52、所述溶劑為醇類溶劑和/或水溶劑，優(yōu)選為醇類溶劑和水。

53、所述醇類溶劑優(yōu)選為甲醇和/或乙醇，更優(yōu)選為甲醇。

54、所述水溶劑為去離子水、蒸餾水或純凈水，更優(yōu)選為去離子水。

55、當(dāng)所述溶劑為醇類溶劑和水溶劑的組合時(shí)，所述醇類溶劑和水溶劑的體積比為1:10～1:500，優(yōu)選為1:50～1:150，更優(yōu)選為1:80～1:100。

56、所述物質(zhì)ia與a的摩爾比為1×104:1～5×104:1，優(yōu)選為1×104:1～3×104:1，更優(yōu)選為2×104:1。

57、所述聚合物x2與a的摩爾比為1×103:1～1×105:1，優(yōu)選為1×104:1～3×104:1，更優(yōu)選為2×104:1。

58、所述聚合物x3與a的摩爾比為1×106:1～5×106:1，優(yōu)選為1×106:1～3×106:1，更優(yōu)選為2×106:1。

59、所述聚合物x2與聚合物x3的摩爾比為為1:50～1:1000，優(yōu)選1:50～1:200，更優(yōu)選為1:100。

60、所述a與溶劑的摩爾體積比為1:50～1:500，優(yōu)選為1:100～1:300，更優(yōu)選為1:202.17。

61、所述物質(zhì)ia與溶劑的摩爾體積比為(50～150):1，優(yōu)選為90:1～120:1，更優(yōu)選為98.93:1。

62、所述聚合物x3與溶劑的摩爾體積比為5000:1～15000:1，優(yōu)選為8000:1～10000:1，更優(yōu)選為9892.66:1。

63、所述a以a的溶液的形式參與反應(yīng)，a的濃度為1～10nmol/l，優(yōu)選為1nmol/l。

64、本發(fā)明提供的一種物質(zhì)，以金納米作為增強(qiáng)基底，具有化學(xué)穩(wěn)定性好、表面等離激元豐富，可大大增強(qiáng)拉曼信號。物質(zhì)表面連接一種拉曼報(bào)告分子x1，即可實(shí)現(xiàn)ros和ph的串聯(lián)響應(yīng)，同時(shí)有基本不變的拉曼峰作為參比，ros響應(yīng)峰、ph響應(yīng)峰和內(nèi)參拉曼峰三者不重疊，可實(shí)現(xiàn)ros和ph的準(zhǔn)確定量。并且該報(bào)告分子在ros不響應(yīng)時(shí)具有ph穩(wěn)定性，因此可實(shí)現(xiàn)ros開啟后的ph波動監(jiān)測。當(dāng)物質(zhì)與ros相互作用時(shí)，報(bào)告分子的ros響應(yīng)基團(tuán)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而引起相對應(yīng)拉曼光譜的改變，不響應(yīng)基團(tuán)拉曼峰與其形成的特征峰比值增大(i不響應(yīng)/i響應(yīng)ros)。在此基礎(chǔ)上，物質(zhì)開啟了ph響應(yīng)性，報(bào)告分子的ph響應(yīng)基團(tuán)在不同ph下結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而引起相對應(yīng)拉曼光譜的改變，不響應(yīng)基團(tuán)拉曼峰與其形成的特征峰比值增大(i不響應(yīng)/i響應(yīng)ph)。

65、本發(fā)明提供的一種物質(zhì)，具有串聯(lián)雙響應(yīng)性和自我比率校準(zhǔn)性，比值信號高、穩(wěn)定性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可成像大腦微環(huán)境中神經(jīng)炎癥部位，進(jìn)而特異性成像腦部疾病環(huán)境中的ph波動，有利于病灶部位的ph監(jiān)測，對于深入理解腦功能變化和疾病進(jìn)展的機(jī)制有重大意義。此外，物質(zhì)上連接的靶向基團(tuán)可特異性識別神經(jīng)炎癥部位腦血管內(nèi)皮細(xì)胞上高表達(dá)的晚期糖基化終產(chǎn)物受體(rage)，引導(dǎo)影像探針通過轉(zhuǎn)胞吞作用穿越血腦屏障，在神經(jīng)炎癥區(qū)域?qū)崿F(xiàn)靶向富集和信號激活。在炎癥區(qū)域，探針響應(yīng)ros，拉曼信號發(fā)生比率型變化，同時(shí)開啟ph監(jiān)測的能力，實(shí)現(xiàn)病灶部位ph波動特異性監(jiān)測，以研究腦功能和腦疾病之間的相關(guān)性。

66、相比于已開發(fā)的多種大腦ph檢測技術(shù)，本發(fā)明的一種物質(zhì)具有“跨血腦屏障高效入腦”、“非病灶區(qū)影響低”、“病灶區(qū)特異性響應(yīng)”、“ros和ph串聯(lián)雙響應(yīng)性”、“自我比率校準(zhǔn)”等特點(diǎn)，可有效提高病灶部位信噪比，并能夠描繪多種腦部疾病環(huán)境中ph波動以深入研究其機(jī)制和開發(fā)新治療策略。