本發(fā)明涉及分子生物，具體涉及一種納米藥物遞送載體表面修飾分子數(shù)目、密度的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、納米藥物具有基于納米結(jié)構(gòu)的尺度效應(yīng)，具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)增加藥物的溶解度，提高藥物的吸收，或消除個(gè)體間差異；(2)通過包載或復(fù)合藥物，提高藥物的體內(nèi)外穩(wěn)定性，或改善藥物的溶出或釋放行為；(3)改善藥物對(duì)組織器官或細(xì)胞的選擇性，提高藥物療效和/或降低藥物的不良反應(yīng)；(4)改變藥物的最終制劑形態(tài)、貯存條件或給藥方式等，降低貯存和運(yùn)輸成本，提高藥品生產(chǎn)和使用的便利性等。在納米藥物表面進(jìn)行功能化修飾可能改善其生物相容性、增加體內(nèi)循環(huán)時(shí)間、實(shí)現(xiàn)靶向遞送等。采用適當(dāng)?shù)谋碚骷夹g(shù)對(duì)納米藥物的表面結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析可提供評(píng)價(jià)信息。相關(guān)研究方法包括x射線光電子能譜技術(shù)(x-rayphotoelectron?spectroscopy，xps)、x射線能量色散譜(energydispersive?x-rayspectroscopy，eds)、飛行時(shí)間-次級(jí)離子質(zhì)譜分析法(time-of-flight?secondary?ionmass?spectrometry，tof-sims)、核磁共振(nuclear?magnetic?resonance，nmr)等。上述方法具有操作較為繁瑣，設(shè)備依賴性強(qiáng)等缺點(diǎn)，并且這些方法只能得到每個(gè)納米載體上的平均修飾分子數(shù)量，不能充分反映納米藥物遞送載體表面修飾分子數(shù)量的分布以及之間的異質(zhì)性。

2、因此，仍亟需一種準(zhǔn)確、高效、操作簡(jiǎn)便，樣品用量小、能夠從單顆粒水平分析納米藥物遞送載體表面修飾分子數(shù)目、密度的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種納米藥物遞送載體表面修飾分子密度的測(cè)量方法，所述測(cè)量方法包括：

2、(1)制備納米藥物遞送載體的熒光標(biāo)記物：將納米藥物遞送載體與已知熒光分子數(shù)n的光學(xué)試劑標(biāo)記的分子捕獲劑混合制備納米藥物遞送載體的熒光標(biāo)記物；

3、(2)測(cè)量納米藥物遞送載體樣本的單顆粒的表面積；所述納米藥物遞送載體樣本包括納米藥物遞送載體和/或納米藥物遞送載體的熒光標(biāo)記物；

4、(3)計(jì)算納米藥物遞送載體表面修飾分子數(shù)目：基于熒光定量微球的熒光強(qiáng)度及其熒光分子數(shù)，獲得熒光分子數(shù)與熒光強(qiáng)度線性關(guān)系，結(jié)合標(biāo)記后納米藥物遞送載體表面的每一個(gè)光學(xué)試劑分子所具有的已知的熒光分子數(shù)，獲得所述納米藥物遞送載體的熒光標(biāo)記物表面熒光分子數(shù)量θ，再基于納米藥物遞送載體表面修飾分子數(shù)目＝納米藥物遞送載體的熒光標(biāo)記物表面熒光分子數(shù)量θ/熒光分子數(shù)n計(jì)算納米藥物遞送載體表面修飾分子數(shù)目；

5、(4)基于步驟(2)獲得的納米藥物遞送載體樣本的單顆粒表面積及步驟(3)獲得的納米藥物遞送載體表面修飾分子數(shù)目，根據(jù)密度＝納米藥物遞送載體表面修飾分子數(shù)目/納米藥物遞送載體樣本的單顆粒表面積，計(jì)算納米藥物遞送載體的表面修飾分子密度。

6、在一些實(shí)施例中，步驟(1)中，通過將含有已知熒光分子數(shù)的光學(xué)試劑標(biāo)記的分子捕獲劑與納米藥物遞送載體混合，使所述光學(xué)試劑與納米藥物遞送載體表面的修飾分子特異性結(jié)合，得到所述納米藥物遞送載體的熒光標(biāo)記物。

7、在一些實(shí)施例中，所述含有已知熒光分子數(shù)的光學(xué)試劑標(biāo)記的分子捕獲劑為能與納米藥物遞送載體表面修飾分子結(jié)合的捕獲劑，使光學(xué)試劑與納米藥物遞送載體表面修飾分子通過捕獲劑特異結(jié)合。

8、在一些實(shí)施例中，步驟(2)中，包括：制備不同粒徑的粒徑標(biāo)準(zhǔn)品的粒徑標(biāo)準(zhǔn)溶液；采用流式顆粒檢測(cè)設(shè)備檢測(cè)所述粒徑標(biāo)準(zhǔn)溶液，記錄粒徑標(biāo)準(zhǔn)溶液的散射光通道檢測(cè)數(shù)據(jù)和/或熒光通道檢測(cè)數(shù)據(jù)，根據(jù)散射光通道檢測(cè)數(shù)據(jù)和/或熒光通道檢測(cè)數(shù)據(jù)和粒徑標(biāo)準(zhǔn)品粒徑值擬合曲線；對(duì)所述納米遞送載體樣本的散射光通道檢測(cè)數(shù)據(jù)和/或熒光通道檢測(cè)數(shù)據(jù)，基于所述擬合曲線，測(cè)量粒徑大小分布，記錄所述納米藥物遞送載體樣本的粒徑大小d；根據(jù)納米藥物遞送載體樣本的粒徑大小，計(jì)算具有散射和/或熒光信號(hào)陽(yáng)性的納米遞送載體樣本的表面積s＝π(d)2。

9、在一些實(shí)施例中，步驟(3)包括：

10、(3.1)采用流式顆粒檢測(cè)設(shè)備檢測(cè)標(biāo)記后的納米藥物遞送載體的熒光標(biāo)記物的熒光強(qiáng)度γ；

11、(3.2)采用(3.1)所述的流式顆粒檢測(cè)設(shè)備和相同熒光信號(hào)采集條件檢測(cè)熒光定量微球的熒光強(qiáng)度f(wàn)，作出熒光強(qiáng)度f(wàn)與熒光分子數(shù)量的線性關(guān)系；熒光定量微球?yàn)槠錈晒夥肿訑?shù)量m為已知的熒光微球；

12、(3.3)根據(jù)步驟(3.2)所述的線性關(guān)系，基于所述納米藥物遞送載體的熒光標(biāo)記物與熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，計(jì)算所述納米藥物遞送載體的熒光標(biāo)記物表面熒光分子數(shù)量θ；進(jìn)而計(jì)算所述納米藥物遞送載體表面修飾分子數(shù)目z＝θ/n。

13、在一些實(shí)施例中，所述納米遞送載體的熒光標(biāo)記物上光學(xué)試劑與標(biāo)準(zhǔn)熒光微球上的光學(xué)試劑為同種或不同種。

14、在一些實(shí)施例中，步驟4)計(jì)算納米遞送載體的表面修飾分子密度為ρ＝z/π(d)2。

15、熒光強(qiáng)度f(wàn)與熒光分子數(shù)量呈現(xiàn)線性關(guān)系，其中熒光分子數(shù)量可用等量參考熒光(equivalent?reference?fluorophores，erf)數(shù)值或可用等量可溶性熒光分子(moleculesequivalent?soluble?fluorochrome，mesf)數(shù)值表示。以mesf數(shù)值表示的熒光定量微球所含有的熒光素分子與待測(cè)熒光標(biāo)記物上熒光素相同。以erf數(shù)值表示的熒光定量微球所含有的熒光素分子與待測(cè)熒光標(biāo)記物上熒光素不同，通過光學(xué)量度測(cè)量計(jì)算后將微球中熒光素?cái)?shù)量換算為對(duì)應(yīng)熒光標(biāo)記物上熒光素?cái)?shù)量。采用的熒光定量微球的方法，通過將包被不同分子數(shù)的熒光定量微球混合，形成含不同數(shù)量熒光素分子的混合熒光定量微球并針對(duì)熒光素分子所用激發(fā)光源和熒光通道進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)算。例如，待測(cè)熒光標(biāo)記物所含的熒光素為af488，采用af488染料標(biāo)記的熒光定量微球，在fitc熒光通道中，對(duì)每一種混合熒光定量微球平均熒光強(qiáng)度(x)與mesf值(y)分別進(jìn)行線性回歸，得公式y(tǒng)＝a+bx。例如，待測(cè)熒光標(biāo)記物所含的熒光素為af647，采用含cy5染料標(biāo)記的熒光定量微球并已知其對(duì)應(yīng)的af647分子數(shù)量，在apc熒光通道中，對(duì)每一種混合熒光定量微球平均熒光強(qiáng)度(x’)與其erf值(y’)分別進(jìn)行線性回歸，得公式y(tǒng)’＝a+bx’。

16、在一些實(shí)施例中，所述流式顆粒檢測(cè)設(shè)備為可實(shí)現(xiàn)樣本流定向流動(dòng)的顆粒分析檢測(cè)設(shè)備；和/或

17、所述定向流體系統(tǒng)由上樣單元以及流動(dòng)單元組成；和/或

18、所述粒子分析檢測(cè)設(shè)備包括光學(xué)系統(tǒng)和顆粒檢測(cè)器；和/或

19、所述顆粒檢測(cè)器為光電傳感器和具有限帶過濾高頻噪音功能的信號(hào)調(diào)理電路組成。

20、在一些實(shí)施例中，所述分子捕獲劑包括選自多肽、蛋白質(zhì)、抗體、配體和/或受體、核酸適配體、酶、生長(zhǎng)因子、糖脂類、多糖、核酸中的至少一種或其組合。

21、在一些實(shí)施例中，所述分子捕獲劑為抗體、抗原、受體、二抗、配體中的至少一種或其組合。

22、所述分子捕獲劑是能與納米藥物遞送載體表面修飾分子結(jié)合的捕獲劑，具體為：所述表面修飾分子為抗原，則分子捕獲劑是抗體；另外，例如幾個(gè)比較有代表性分子捕獲劑與納米藥物遞送載體表面修飾分子的關(guān)系：一抗—二抗；酶—底物；酶—抑制劑；激素—受體；配體—受體；電子供體—電子受體；蛋白—適配體等。

23、通過將納米藥物遞送載體與已知熒光分子數(shù)n的光學(xué)試劑標(biāo)記的分子捕獲劑混合孵育，使光學(xué)試劑能夠與納米藥物遞送載體表面修飾分子通過捕獲劑特異結(jié)合。在一些實(shí)施例中，所述納米藥物遞送載體包括病毒載體和非病毒載體。

24、在一些實(shí)施例中，所述病毒載體包括慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、單純皰疹病毒載體、重組冠狀病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體等。

25、在一些實(shí)施例中，所述非病毒載體包括外泌體、細(xì)胞外囊泡、脂質(zhì)納米顆粒、脂質(zhì)體、mrna疫苗、陽(yáng)離子聚合物、陽(yáng)離子脂質(zhì)、無(wú)機(jī)納米顆粒、核酸偶聯(lián)物等。

26、在一些實(shí)施例中，所述光學(xué)試劑包括有機(jī)熒光分子、熒光蛋白、核酸染料、脂膜染料、量子點(diǎn)、polymer?dots中的至少一種或其組合。

27、在一些實(shí)施例中，本發(fā)明涉及步驟(3.2)在采用流式顆粒檢測(cè)設(shè)備檢測(cè)時(shí)各所述相同熒光信號(hào)采集條件外的其它采集條件可以相同也可以不同，例如：在步驟(3.2)在檢測(cè)熒光定量微球時(shí)所采用的一定進(jìn)樣壓力與在步驟(3.1)納米藥物遞送載體的熒光標(biāo)記物所采用的一定進(jìn)樣壓力可以相同也可以不同。

28、術(shù)語(yǔ)說(shuō)明

29、現(xiàn)在詳細(xì)描述本發(fā)明的某些實(shí)施方案。本發(fā)明意圖涵蓋所有的替代、修改和等同技術(shù)方案，它們均包括在如權(quán)利要求定義的本發(fā)明范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，許多與本文所述類似或等同的方法和材料能夠用于實(shí)踐本發(fā)明。本發(fā)明絕不限于本文所述的方法和材料。在所結(jié)合的文獻(xiàn)、專利和類似材料的一篇或多篇與本技術(shù)不同或相矛盾的情況下(包括但不限于所定義的術(shù)語(yǔ)、術(shù)語(yǔ)應(yīng)用、所描述的技術(shù)，等等)，以本技術(shù)為準(zhǔn)。

30、應(yīng)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的某些特征，為清楚可見，在多個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案中進(jìn)行了描述，但也可以在單個(gè)實(shí)施例中以組合形式提供。反之，本發(fā)明的各種特征，為簡(jiǎn)潔起見，在單個(gè)實(shí)施方案中進(jìn)行了描述，但也可以單獨(dú)或以任意適合的子組合提供。

31、除非另外說(shuō)明，本發(fā)明所使用的所有科技術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的通常理解相同的含義。本發(fā)明涉及的所有專利和公開出版物通過引用方式整體并入本發(fā)明。

32、在本說(shuō)明書的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說(shuō)明書中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不必須針對(duì)的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說(shuō)明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

33、在下面的內(nèi)容中，無(wú)論是否使用“大約”或“約”等字眼，所有在此公開了的數(shù)字均為近似值。每一個(gè)數(shù)字的數(shù)值有可能會(huì)出現(xiàn)1％、2％、5％、7％、8％、10％、15％或20％等差異。每當(dāng)公開一個(gè)具有n值的數(shù)字時(shí)，任何具有n+/-1％、n+/-2％、n+/-3％、n+/-5％、n+/-7％、n+/-8％、n+/-10％、n+/-15％或n+/-20％值的數(shù)字會(huì)被明確地公開，其中“+/-”是指加或減。

34、“粒徑標(biāo)準(zhǔn)溶液”為一種已知粒徑大小的微球顆粒，其表面或/和內(nèi)部含或不含有一種或者多種熒光染料。

35、“熒光定量微球”為一種其表面或內(nèi)部已知熒光分子數(shù)的微球，包含等量參考熒光(equivalent?reference?fluorophores，erf)微球或等量可溶性熒光分子(moleculesequivalent?soluble?fluorochrome，mesf)微球。該微球可以為商品化提供標(biāo)定的熒光分子數(shù)的微球或通過光學(xué)量度測(cè)量計(jì)算后獲得其熒光分子數(shù)的微球。

36、“已知熒光分子數(shù)的光學(xué)試劑”可以為商品化提供標(biāo)定的熒光分子數(shù)的光學(xué)試劑或通過光學(xué)量度測(cè)量計(jì)算后獲得其熒光分子數(shù)的光學(xué)試劑。

37、術(shù)語(yǔ)“核酸適配體”是指已經(jīng)通過反復(fù)循環(huán)的體外選擇或selex(通過指數(shù)富集的配體的系統(tǒng)進(jìn)化)工程化以結(jié)合至靶分子的核酸分子。核酸適配體可以是dna或rna分子。適配體可以包含修飾，例如，經(jīng)修飾的核苷酸，例如2’-氟取代的嘧啶。