本發(fā)明屬于皮質(zhì)醇檢測，涉及一種磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法測定人唾液中皮質(zhì)醇的試劑盒。

背景技術(shù)：

1、皮質(zhì)醇(cor)是由腎上腺皮質(zhì)束狀帶分泌的一種激素，在人體內(nèi)以結(jié)合態(tài)和游離態(tài)兩種形式存在。游離態(tài)皮質(zhì)醇約占總量的10％，具有生物活性，可以從腎臟濾過；而結(jié)合態(tài)皮質(zhì)醇主要與糖皮質(zhì)類固醇結(jié)合蛋白(cbg)相結(jié)合，少量與白蛋白結(jié)合，不具備生物活性，不能從腎小球?yàn)V過。皮質(zhì)醇的分泌受到垂體分泌的促腎上腺皮質(zhì)激素(acth)的調(diào)節(jié)，并表現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律，通常在上午8時左右達(dá)到峰值，隨后逐漸下降至午夜達(dá)到最低值。血漿總皮質(zhì)醇(f)的臨床檢測通常采用化學(xué)發(fā)光免疫法。

2、下丘腦-垂體-腎上腺(hpa)軸是人體的關(guān)鍵生物應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)。研究表明，當(dāng)個體遭受壓力時，無論是在晝夜周期內(nèi)的任何時間，皮質(zhì)醇水平都會增加。壓力會導(dǎo)致hpa軸分泌糖皮質(zhì)激素(如皮質(zhì)醇)增加，這些激素能夠啟動產(chǎn)生有益能量的適應(yīng)過程，但長期或不適當(dāng)?shù)姆置趧t可能帶來負(fù)面影響，如增加各種精神和情緒障礙的風(fēng)險，包括抑郁癥、焦慮癥、慢性疲勞綜合癥和發(fā)展性精神疾病等。

3、盡管血清皮質(zhì)醇水平是目前研究的重點(diǎn)，唾液皮質(zhì)醇水平已被證明與血清皮質(zhì)醇水平具有高度一致性，尤其在晝夜周期和不同的節(jié)律下表現(xiàn)穩(wěn)定。唾液皮質(zhì)醇檢測作為一種無創(chuàng)、簡便的檢測方法，對于監(jiān)測個體的壓力狀態(tài)具有重要意義。例如，在當(dāng)前的社會背景下，研究生的壓力水平普遍高于本科生，這表明唾液皮質(zhì)醇含量可以作為一個有效的壓力監(jiān)測指標(biāo)。

4、唾液采集相較于血液采集更為便利，可以在任何地點(diǎn)進(jìn)行，無需專業(yè)人員的幫助，特別適用于兒童、青少年以及暈血癥患者。此外，唾液中的皮質(zhì)醇幾乎全部以游離狀態(tài)存在，能夠更好地反映皮質(zhì)醇的生物活性及其與壓力的關(guān)系。

5、鑒于以上原因，開發(fā)一種基于唾液樣本的皮質(zhì)醇檢測方法具有重要的臨床意義和實(shí)際需求，有助于改善個體心理健康評估的方式，并為相關(guān)疾病的早期診斷提供支持。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中皮質(zhì)醇檢測存在的問題，提供一種磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法測定人唾液中皮質(zhì)醇的試劑盒。

2、本發(fā)明的第一個目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

3、一種磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法測定人唾液中皮質(zhì)醇的試劑盒，所述試劑盒包括皮質(zhì)醇抗體包被的磁微粒試劑、皮質(zhì)醇抗原發(fā)光標(biāo)記物試劑、皮質(zhì)醇校準(zhǔn)品、樣本稀釋液。

4、作為優(yōu)選，所述皮質(zhì)醇抗體包被的磁微粒試劑的濃度為0.5～2mg/ml，例如可以是0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml等；

5、進(jìn)一步優(yōu)選，所述皮質(zhì)醇抗體為深圳重鏈生物科技有限公司生產(chǎn)的重組綿羊抗-皮質(zhì)醇單抗(1a5s)。

6、作為優(yōu)選，所述皮質(zhì)醇抗原發(fā)光標(biāo)記物試劑的濃度為0.05～0.2μg/ml，例如可以是0.05ug/ml、0.1ug/ml、0.15ug/ml、0.2ug/ml；所述皮質(zhì)醇抗原發(fā)光標(biāo)記物為化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記皮質(zhì)醇抗原，其中化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為吖啶酯。

7、進(jìn)一步優(yōu)選，所述皮質(zhì)醇抗原為安提生物科技有限公司生產(chǎn)的皮質(zhì)醇-bsa抗原。

8、吖啶酯是一類可用作化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的化學(xué)物質(zhì)，根據(jù)取代基的不同分為不同種類的吖啶取代物，常用作化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的吖啶取代物結(jié)構(gòu)中都有吖啶環(huán)，它們具有相同的發(fā)光機(jī)理：在堿性h2o2溶液中，分子受到過氧化氫離子進(jìn)攻時，生成不穩(wěn)定的二氧乙烷，二氧乙烷分解為co2和電子激發(fā)態(tài)的n-甲基吖啶酮，當(dāng)其回到基態(tài)時發(fā)出最大發(fā)射波長為430nm的光子。

9、作為優(yōu)選，所述皮質(zhì)醇校準(zhǔn)品包括濃度為0ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml的皮質(zhì)醇校準(zhǔn)品。

10、作為優(yōu)選，所述樣本稀釋液中包括十六烷基三甲基溴化銨(cetab)。

11、本發(fā)明主要是以磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)檢測唾液中皮質(zhì)醇含量，建立通過唾液對人體游離皮質(zhì)醇進(jìn)行檢測，達(dá)到對應(yīng)激反應(yīng)，精神緊張，以及過度焦慮人群初篩的目的；同時可監(jiān)測不同時間皮質(zhì)醇含量變化，用于監(jiān)測機(jī)體的壓力狀態(tài)變化，以及干預(yù)或者治療后人群的預(yù)后跟蹤。且無主觀性，有很高的臨床價值和實(shí)際需求。

12、作為優(yōu)選，所述皮質(zhì)醇抗體包被的磁微粒試劑的制備方法包括以下步驟：將磁微粒分散在包被緩沖液中形成分散液，然后加入皮質(zhì)醇抗體進(jìn)行偶聯(lián)，在催化劑作用下進(jìn)行混懸反應(yīng)；混懸完畢后，加入封閉劑進(jìn)行封閉反應(yīng)；最后加入包被稀釋液進(jìn)行重懸，得到皮質(zhì)醇抗體包被的磁微粒試劑。

13、磁微粒是一類特殊的復(fù)合材料，由無機(jī)磁性物質(zhì)和有機(jī)或無機(jī)涂層組成，具有超順磁性和高度穩(wěn)定性。它們可以通過表面改性方法被賦予特定的功能基團(tuán)，從而使得磁性微粒能夠與抗體、抗原、酶等生物分子結(jié)合。在化學(xué)發(fā)光免疫分析中，磁性微粒作為固相載體，通過磁場快速分離目標(biāo)分子，實(shí)現(xiàn)高效、高靈敏度檢測。

14、所述皮質(zhì)醇抗體包被的磁微粒試劑的制備方法中，作為優(yōu)選，磁微粒的粒徑為0.5～3.0μm。

15、所述皮質(zhì)醇抗體包被的磁微粒試劑的制備方法中，作為優(yōu)選，磁微粒在分散液中的濃度為5～20mg/ml。

16、所述皮質(zhì)醇抗體包被的磁微粒試劑的制備方法中，作為優(yōu)選，包被緩沖液可采用包括hepes、mes、硼酸、磷酸鹽緩沖液中的一種或多種。

17、所述皮質(zhì)醇抗體包被的磁微粒試劑的制備方法中，作為優(yōu)選，包被緩沖液的濃度為20～50mmol，ph為5.7～8.0。

18、所述皮質(zhì)醇抗體包被的磁微粒試劑的制備方法中，作為優(yōu)選，磁微粒與皮質(zhì)醇抗體的質(zhì)量比為1:(10～20)，“1:(10～20)”例如可以是1:10、1:12、1:14、1:16、1:18、1:20等。

19、所述皮質(zhì)醇抗體包被的磁微粒試劑的制備方法中，作為優(yōu)選，催化劑為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺。

20、所述皮質(zhì)醇抗體包被的磁微粒試劑的制備方法中，作為優(yōu)選，催化劑配制濃度為5～20mg/ml，“5～20mg/ml”例如可以是5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml等。

21、所述皮質(zhì)醇抗體包被的磁微粒試劑的制備方法中，作為優(yōu)選，磁性微粒和催化劑的比例為1mg:(50～100)μl，“(50～100)μl”例如可以是50μl、60μl、70μl、80μl、90μl、100μl等。

22、所述皮質(zhì)醇抗體包被的磁微粒試劑的制備方法中，作為優(yōu)選，混懸反應(yīng)溫度為18～25℃，反應(yīng)時間為2～4h，“2～4h”例如可以是2h、2.5h、3h、3.5h、4h等。

23、所述皮質(zhì)醇抗體包被的磁微粒試劑的制備方法中，作為優(yōu)選，封閉劑由ph為5.7～8.0，濃度為0.05～0.2mol/l的磷酸鹽緩沖液中加入1～10wt％bsa配制得到。

24、所述皮質(zhì)醇抗體包被的磁微粒試劑的制備方法中，作為優(yōu)選，磁性微粒和封閉劑的比例為1mg:(100～150)μl，“(100～150)μl”例如可以是100μl、110μl、120μl、130μl、140μl、150μl等。

25、所述皮質(zhì)醇抗體包被的磁微粒試劑的制備方法中，作為優(yōu)選，封閉反應(yīng)溫度為18～25℃，反應(yīng)時間為1～2h，“1～2h”例如可以是1h、1.5h、2h等。

26、所述皮質(zhì)醇抗體包被的磁微粒試劑的制備方法中，作為優(yōu)選，包被稀釋液采用pbs，濃度為20～50mmol，ph為5.7～8.0。

27、作為優(yōu)選，所述皮質(zhì)醇抗原發(fā)光標(biāo)記物試劑的制備方法包括以下步驟：將皮質(zhì)醇抗原加入標(biāo)記緩沖液中，再加入化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)；然后加入淬滅劑進(jìn)行淬滅反應(yīng)；將反應(yīng)產(chǎn)物通過層析柱進(jìn)行凈化，最后加入標(biāo)記稀釋液得到皮質(zhì)醇抗原發(fā)光標(biāo)記物試劑。

28、所述皮質(zhì)醇抗原發(fā)光標(biāo)記物試劑的制備方法中，作為優(yōu)選，皮質(zhì)醇抗原在標(biāo)記緩沖液中的濃度為0.5～2mg/ml。

29、所述皮質(zhì)醇抗原發(fā)光標(biāo)記物試劑的制備方法中，作為優(yōu)選，標(biāo)記緩沖液為pbs，濃度為20～100mmol，ph為5.7～8.0。

30、所述皮質(zhì)醇抗原發(fā)光標(biāo)記物試劑的制備方法中，作為優(yōu)選，標(biāo)記反應(yīng)加入的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物以溶液形式加入，將化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物溶解在二甲基甲酰胺中制備得到化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物溶液，所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物溶液濃度為1～5mg/ml，置于-30～-15℃保存。

31、所述皮質(zhì)醇抗原發(fā)光標(biāo)記物試劑的制備方法中，作為優(yōu)選，皮質(zhì)醇抗原和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的標(biāo)記比例為1:(1～8)，標(biāo)記反應(yīng)時間為10～60min。

32、所述皮質(zhì)醇抗原發(fā)光標(biāo)記物試劑的制備方法中，作為優(yōu)選，淬滅劑由ph為5.7～8.0，濃度為30～60mmol的pbs中加入1～3wt％賴氨酸配制得到。

33、所述皮質(zhì)醇抗原發(fā)光標(biāo)記物試劑的制備方法中，作為優(yōu)選，按淬滅劑和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為1:(1～10)的比例加入淬滅劑，淬滅反應(yīng)時間為10～60min。

34、所述皮質(zhì)醇抗原發(fā)光標(biāo)記物試劑的制備方法中，作為優(yōu)選，將反應(yīng)產(chǎn)物過pd10層析柱，通過顏色進(jìn)行收集，初始為淡黃色，直至無色，澄清為止。

35、所述皮質(zhì)醇抗原發(fā)光標(biāo)記物試劑的制備方法中，作為優(yōu)選，標(biāo)記稀釋液由ph為5.7～8.0，濃度為0.05～0.2mol/l的磷酸鹽緩沖液中加入1～10wt％bsa配制得到。

36、作為優(yōu)選，所述皮質(zhì)醇校準(zhǔn)品由皮質(zhì)醇抗原用校準(zhǔn)品稀釋液進(jìn)行稀釋后得到。

37、所述皮質(zhì)醇校準(zhǔn)品中，作為優(yōu)選，校準(zhǔn)品稀釋液為0.05～0.2mol/l的磷酸鹽緩沖液中加入1～10wt％bsa配制得到。

38、作為優(yōu)選，所述樣本稀釋液由ph為5.7～8.0，濃度為0.05～0.2mol/l的磷酸鹽緩沖液中加入1～3wt％的十六烷基三甲基溴化銨(cetab)配制得到。

39、本發(fā)明的第二個目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

40、一種使用上述試劑盒采用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測人唾液中皮質(zhì)醇的測定方法，所述測定方法不以疾病的診斷或治療為目的，所述測定方法包括以下步驟：首先進(jìn)行唾液樣本采集，并通過前處理得到待測樣本；將待測樣本與樣本稀釋液混合均勻得到稀釋樣本，然后加入皮質(zhì)醇抗體包被的磁微粒試劑混合均勻并進(jìn)行孵育，得到磁性復(fù)合物懸浮液；將磁性復(fù)合物懸浮液置于磁場內(nèi)進(jìn)行磁性分離得到磁性復(fù)合物并進(jìn)行洗滌；然后加入皮質(zhì)醇抗原發(fā)光標(biāo)記物試劑，檢測化學(xué)發(fā)光光子強(qiáng)度。

41、作為優(yōu)選，所述測定方法中，唾液樣本前處理包括以下步驟：將采集的唾液樣本送入離心機(jī)中在10000～15000rpm下離心10～30min，取上清液得到無絮狀物唾液，即為待測樣本。

42、待測樣本收集后室溫條件下放置應(yīng)不超過4h，2～8℃保存應(yīng)不超過7天，如果無法在采集后1周內(nèi)進(jìn)行測定，則將樣本密封后置于-20℃以下，不超過6個月，反復(fù)凍融不可超過3次，使用前恢復(fù)至室溫，混勻即可。

43、作為優(yōu)選，所述測定方法中，待測樣本與樣本稀釋液按質(zhì)量比(1～5):(1～5)混合均勻得到稀釋樣本。

44、作為優(yōu)選，所述測定方法中，稀釋樣本、皮質(zhì)醇抗體包被的磁微粒試劑和皮質(zhì)醇抗原發(fā)光標(biāo)記物試劑的比例為(1～10):(1～5):(1～5)。

45、作為優(yōu)選，所述測定方法中，孵育溫度為30～60℃，孵育時間為10～60min。

46、作為優(yōu)選，所述測定方法中，磁分離時間為1～5min，用以去除未結(jié)合的成分。

47、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

48、1、本發(fā)明試劑盒采用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)檢測人體唾液中皮質(zhì)醇濃度。由于唾液中皮質(zhì)醇含量相較與血液中含量更低，本發(fā)明試劑盒通過優(yōu)選的抗原抗體原料配對，與常規(guī)檢測血液皮質(zhì)醇的試劑盒相比，具有更為精確的靈敏度。

49、2、本發(fā)明提供的一種磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法測定人唾液中皮質(zhì)醇的試劑盒，采用了優(yōu)選的樣本稀釋液，在檢測過程中可以有效避免唾液中粘蛋白因過于粘稠而導(dǎo)致出現(xiàn)堵塞加樣針的情況，使測試結(jié)果不準(zhǔn)確，使用本發(fā)明的樣本稀釋液可以有效消除粘蛋白對測試結(jié)果的影響。

50、3、本發(fā)明提供的一種磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法測定人唾液中皮質(zhì)醇的試劑盒，與常規(guī)血液檢測相比，不用進(jìn)行采血可實(shí)現(xiàn)無痛無創(chuàng)口，且無需專業(yè)人士進(jìn)行采樣，患者可按照采樣說明，自行完成采樣工做，操作簡單；同時可達(dá)到無干擾，血液樣本中成分和唾液相比成分復(fù)雜，容易受到血液中膽紅素、血紅蛋白、甘油三酯等物質(zhì)的干擾，導(dǎo)致出現(xiàn)假陽情況，而唾液為體液滲出物，成分更為簡單，不會受到其他物質(zhì)的干擾，檢測的準(zhǔn)確率更高。

51、4、本發(fā)明提供的一種磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法測定人唾液中皮質(zhì)醇的試劑盒，有效解決了臨床檢測血液中皮質(zhì)醇的局限性，臨床意義多為監(jiān)測腎上腺功能、庫氏綜合征，過程繁瑣復(fù)雜，對低值患者的檢測效率不佳；而本發(fā)明在臨床實(shí)踐中可通過唾液隨時隨地多次進(jìn)行取樣，實(shí)現(xiàn)對相關(guān)人群的多頻次和高密度篩查，達(dá)到及早發(fā)現(xiàn)及早治療的目的，從而使得焦慮、壓力大等癥狀體現(xiàn)得更明顯，精確度更大。