本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)組學(xué)研究方向蛋白質(zhì)翻譯后修飾鑒定，具體涉及一種通過(guò)熱蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)高通量、高覆蓋度的d-蛋白質(zhì)的規(guī)?；Y選方法。

背景技術(shù)：

1、在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)的組成主要是由l-氨基酸通過(guò)肽鍵連接而成。然而，在原核生物、真核生物、動(dòng)物以及人體的蛋白質(zhì)中，也發(fā)現(xiàn)了少量d-氨基酸的存在。前期研究表明，這些d-氨基酸主要是由l-氨基酸經(jīng)外消旋化反應(yīng)形成的。外消旋化被認(rèn)為是一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾類(lèi)型，在人體中以天冬氨酸的外消旋化為主，其次是絲氨酸和谷氨酸。氨基酸的外消旋化可以影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和功能，并已證實(shí)與某些疾病的發(fā)生相關(guān)。近年來(lái)的研究表明，氨基酸的外消旋化受到自由基、ph值、酶和溫度等多種因素的影響。由于d-氨基酸與l-氨基酸在分子量上完全相同，因此無(wú)法用傳統(tǒng)質(zhì)譜直接監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)中氨基酸外消旋化。

2、因此，迫切需要開(kāi)發(fā)一種新的技術(shù)，用于規(guī)?；R(shí)別和篩選d-蛋白質(zhì)。熱蛋白質(zhì)組學(xué)方法利用蛋白質(zhì)在加熱條件下會(huì)發(fā)生變性且溶解性降低的原理，可以用來(lái)發(fā)現(xiàn)熱敏感蛋白。目前基于質(zhì)譜的熱蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法已被廣泛應(yīng)用于糖基化修飾的發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)和藥物分子、蛋白質(zhì)和代謝物、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用等系列研究中。大部分d-蛋白質(zhì)比經(jīng)典l-蛋白具有更高的熱穩(wěn)定性，因此可通過(guò)熱穩(wěn)定性差異實(shí)現(xiàn)對(duì)d-蛋白的鑒別。然而，受限于驗(yàn)證手段和數(shù)據(jù)檢索等方面的技術(shù)難題，目前仍沒(méi)有基于熱蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的d-蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)相關(guān)方面的報(bào)道。

3、通過(guò)開(kāi)發(fā)面向d-蛋白質(zhì)規(guī)?；l(fā)現(xiàn)的熱蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)流程和海量蛋白組數(shù)據(jù)中d-蛋白質(zhì)信息檢索提取方法，可以從組學(xué)數(shù)據(jù)集中高靈敏度、高覆蓋度地獲取潛在目標(biāo)蛋白的信息，準(zhǔn)確識(shí)別潛在的異構(gòu)化修飾結(jié)構(gòu)域及其位點(diǎn)。這樣的規(guī)?；b定方法的開(kāi)發(fā)將有助于更全面地研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾對(duì)其生理功能的影響，發(fā)現(xiàn)并研究更多與氨基酸外消旋化相關(guān)的疾病，并探索d-蛋白是否可以作為疾病潛在的生物標(biāo)志物等方面提供新的思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問(wèn)題，并提供至少后面將說(shuō)明的優(yōu)點(diǎn)。

2、本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種基于熱蛋白組學(xué)技術(shù)的d-蛋白質(zhì)規(guī)模化篩選方法，，其首先通過(guò)梯度加熱蛋白質(zhì)組學(xué)提取物，分離收集加熱后的上清液，通過(guò)定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法對(duì)d-蛋白質(zhì)上調(diào)組和空白組的上清液進(jìn)行分析，輔以立體異構(gòu)檢索，篩選出潛在的d-蛋白質(zhì)，隨后應(yīng)用氨肽酶酶切(apm酶切)技術(shù)，最終獲得d-蛋白質(zhì)的d位點(diǎn)；本發(fā)明可高靈敏度和高覆蓋度地獲取潛在目標(biāo)蛋白的信息，并輔助識(shí)別潛在的異構(gòu)化修飾結(jié)構(gòu)域及其位點(diǎn)。相比其他鑒定蛋白質(zhì)外消旋化方法，本發(fā)明具備更高的分析通量、靈敏度和選擇性，為d-蛋白質(zhì)的大規(guī)模篩選提供了可靠的技術(shù)手段。

3、為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種基于熱蛋白組學(xué)技術(shù)的d-蛋白質(zhì)規(guī)?；Y選方法，其包括：

4、步驟一、通過(guò)向細(xì)胞中分別加入蛋白處理劑和不加入蛋白處理劑，得到d-蛋白質(zhì)上調(diào)組和空白組；

5、步驟二、基于d-蛋白質(zhì)上調(diào)組和空白組，利用熱蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，獲取熱穩(wěn)定性差異蛋白列表；

6、步驟三、利用異構(gòu)檢索技術(shù)，獲取立體異構(gòu)蛋白列表；

7、步驟四、將步驟二得到的熱穩(wěn)定性差異蛋白列表與步驟三得到的立體異構(gòu)蛋白列表進(jìn)行比對(duì)分析，并取二者的交集，得潛在的d-蛋白質(zhì)；

8、步驟五、基于apm酶切技術(shù)，獲取步驟四得到潛在的d-蛋白質(zhì)的d位點(diǎn)。

9、優(yōu)選的是，所述的基于熱蛋白組學(xué)技術(shù)的d-蛋白質(zhì)規(guī)模化篩選方法，步驟一具體為：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，均分為兩組，向其中一組中加入30μm蛋白處理劑得d-蛋白質(zhì)上調(diào)組，另外一組不加入蛋白處理劑得空白組。

10、優(yōu)選的是，所述的基于熱蛋白組學(xué)技術(shù)的d-蛋白質(zhì)規(guī)?；Y選方法，步驟二具體為：

11、s201、將d-蛋白質(zhì)上調(diào)組和空白組分別懸浮于緩沖溶液中，隨后向緩沖溶液中加入蛋白酶抑制劑(蛋白酶抑制劑加入后終體積分?jǐn)?shù)為1％)，通過(guò)液氮反復(fù)凍融三次后，離心收集第一上清液，分別得d-蛋白質(zhì)上調(diào)組蛋白溶液和空白組蛋白溶液；

12、s202、將d-蛋白質(zhì)上調(diào)組蛋白溶液/空白組蛋白溶液均分至多個(gè)試管中，多個(gè)試管分別置于不同溫度下進(jìn)行熱處理，對(duì)熱處理后的每個(gè)試管進(jìn)行離心收集第二上清液；

13、s203、利用尿素對(duì)每個(gè)第二上清液進(jìn)行變性處理，隨后利用dtt和iaa進(jìn)行烷基化處理，對(duì)變性烷基化處理后的每個(gè)第二上清液進(jìn)行酶解，離心收集肽段溶液，經(jīng)除鹽后復(fù)溶于甲酸溶液中，得多肽分析樣品；

14、s204、對(duì)每個(gè)多肽分析樣品進(jìn)行l(wèi)c-ms/ms檢測(cè)分析，采集蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)集，依次采用tpp數(shù)據(jù)分析以及響應(yīng)曲線的非參數(shù)數(shù)據(jù)分析方法，對(duì)蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，獲取熱穩(wěn)定性差異蛋白列表。

15、優(yōu)選的是，所述的基于熱蛋白組學(xué)技術(shù)的d-蛋白質(zhì)規(guī)模化篩選方法，步驟三具體為：

16、s301、從步驟s204獲取的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集中獲取最低溫度對(duì)應(yīng)的構(gòu)象分辨蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)，包括同一氨基酸序列的立體異構(gòu)多肽保留時(shí)間信息、串聯(lián)質(zhì)譜信息、碰撞橫截面積以及立體異構(gòu)體信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度；

17、s302、將所述構(gòu)象分辨蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)中的氨基酸序列通過(guò)搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)生成的數(shù)據(jù)集進(jìn)行特征提取，得到蛋白質(zhì)樣本的多條特征數(shù)據(jù)，以建立蛋白質(zhì)樣本異構(gòu)修飾檢索的特征集，每條特征數(shù)據(jù)均包括蛋白質(zhì)名稱(chēng)、氨基酸序列、色譜的保留時(shí)間、電荷、信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度、質(zhì)荷比和二級(jí)質(zhì)譜圖；

18、s303、對(duì)于同一個(gè)氨基酸序列下的特征數(shù)據(jù)，刪除保留時(shí)間差值小于2min和/或碰撞橫截面積差值小于1.5％的數(shù)據(jù)，獲取立體異構(gòu)蛋白列表。

19、優(yōu)選的是，所述的基于熱蛋白組學(xué)技術(shù)的d-蛋白質(zhì)規(guī)模化篩選方法，其特征在于，步驟五具體為：將步驟四得到的潛在的d-蛋白質(zhì)用氨肽酶進(jìn)行酶切，采用lc-ms/ms進(jìn)行組學(xué)數(shù)據(jù)采集和分析，將質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)maxquant處理，分析peptide文件，找到相應(yīng)的d位點(diǎn)。

20、優(yōu)選的是，所述的基于熱蛋白組學(xué)技術(shù)的d-蛋白質(zhì)規(guī)?；Y選方法，步驟s201中緩沖溶液為pbs緩沖溶液。

21、優(yōu)選的是，所述的基于熱蛋白組學(xué)技術(shù)的d-蛋白質(zhì)規(guī)模化篩選方法，步驟s202中的第二上清液的變性烷基化處理具體為：向第二上清液中加入同體積16m尿素使蛋白溶液變性，然后加入100mm?dtt，使其終濃度為10mm，于37℃下孵育30min后加入200mm?iaa，使其終濃度為50mm，室溫避光孵育30min后加入100mm?dtt使其終濃度為10mm，孵育5min，即得。

22、優(yōu)選的是，所述的基于熱蛋白組學(xué)技術(shù)的d-蛋白質(zhì)規(guī)模化篩選方法，步驟s203中通過(guò)加入胰蛋白酶對(duì)變性烷基化處理后的每個(gè)第二上清液進(jìn)行酶解，胰蛋白酶與變性烷基化處理后的第二上清液中可溶性蛋白的質(zhì)量比為1:100。

23、優(yōu)選的是，所述的基于熱蛋白組學(xué)技術(shù)的d-蛋白質(zhì)規(guī)?；Y選方法，步驟s202具體為：將d-蛋白質(zhì)上調(diào)組蛋白溶液/空白組蛋白溶液均分至10個(gè)試管中，分別置于37℃、39℃、42℃、45℃、49℃、53℃、57℃、62℃、65℃、67℃下加熱3min后，迅速置于冰水浴中冷卻4min，然后于4℃、20,000g離心力下離心15min，收集第二上清液。

24、本發(fā)明至少包括以下有益效果：

25、1)高通量性能：利用熱蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，在無(wú)需對(duì)d-蛋白質(zhì)上調(diào)組蛋白進(jìn)行預(yù)處理的情況下，能夠快速、高效地篩選出大量的d-蛋白質(zhì)，為大規(guī)模研究提供了可行性，節(jié)約了時(shí)間和資源成本；

26、2)定量準(zhǔn)確度高和成本效益：相較于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性tmt標(biāo)簽定量方法，本方法采用了dia非標(biāo)記定量技術(shù)。這種方法提高了數(shù)據(jù)的可重復(fù)性、蛋白質(zhì)的鑒定數(shù)量和定量準(zhǔn)確度，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，同時(shí)降低了試劑成本，從而顯著提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。

27、3)普適性強(qiáng)，覆蓋度廣，無(wú)歧視：本發(fā)明采用兩種篩選手段來(lái)識(shí)別潛在的d-蛋白質(zhì)，一種是基于蛋白質(zhì)熔解曲線之間δtm的差異，另一種是直接計(jì)算擬合曲線的benjamini&hochberg校正p值，這種雙重篩選方法避免了一些因?yàn)槿劢馇€無(wú)法計(jì)算δtm而被漏檢的蛋白質(zhì)，不僅更直觀地反映了蛋白質(zhì)在立體異構(gòu)修飾前后的熱穩(wěn)定性變化，而且提高了對(duì)d-蛋白質(zhì)的鑒定覆蓋率，減少了假陰性結(jié)果的可能性。

28、4)廣泛適用性：本發(fā)明適用于各種類(lèi)型的樣品，包括生物體組織、細(xì)胞培養(yǎng)物、生物體液等，使得研究者能夠在不同的研究對(duì)象中進(jìn)行d-蛋白的發(fā)現(xiàn)與分析。

29、5)臨床應(yīng)用前景：本發(fā)明為尋找d-蛋白在疾病診斷、治療及預(yù)后評(píng)估等臨床應(yīng)用方面的潛在價(jià)值提供了強(qiáng)有力的支持，有望為相關(guān)領(lǐng)域的臨床轉(zhuǎn)化研究提供新的思路和方法。

30、6)成本效益：本發(fā)明能夠高效處理大量樣品，因此可以降低單個(gè)樣品的處理成本，提高了研究的經(jīng)濟(jì)效益。

31、7)數(shù)據(jù)共享與比對(duì)：本發(fā)明產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可供研究者進(jìn)行共享和比對(duì)，有助于形成更全面、更系統(tǒng)的d-蛋白數(shù)據(jù)資源，促進(jìn)相關(guān)領(lǐng)域的合作與發(fā)展。

32、本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過(guò)下面的說(shuō)明體現(xiàn)，部分還將通過(guò)對(duì)本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。