本發(fā)明涉及生物芯片，具體而言，涉及一種基于等離激元表面晶格共振的dna折紙微陣列生物芯片及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、生物芯片是一種通過(guò)在小的固體基底上固定大量分子探針來(lái)實(shí)現(xiàn)高通量生物分子檢測(cè)和分析的技術(shù)，用于藥物作用研究、傳染病檢測(cè)、癌癥診斷、藥物篩選、食品安全監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。借助表面等離激元共振（surface?plasmon?resonance,?spr）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence?resonance?energy?transfer,?fret）等光傳感機(jī)理設(shè)計(jì)的光傳感生物芯片，能夠快速響應(yīng)并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。其中基于spr的光傳感可實(shí)現(xiàn)無(wú)標(biāo)記檢測(cè)，即不需要對(duì)生物分子進(jìn)行熒光或放射性標(biāo)記，減少了樣品制備步驟，降低了成本，并避免了標(biāo)記對(duì)生物分子結(jié)構(gòu)和功能的改變。因此，spr在無(wú)標(biāo)記生物檢測(cè)的作用近年來(lái)引起了人們的高度重視。

2、spr效應(yīng)是等離激元納米材料的重要光學(xué)特性?；趕pr的無(wú)標(biāo)記檢測(cè)原理為：當(dāng)光源與芯片上的等離激元納米材料發(fā)生表面等離激元共振時(shí)，其在消光光譜上會(huì)產(chǎn)生一個(gè)強(qiáng)共振峰。當(dāng)有生物分子與等離激元納米材料附近的分子相互作用時(shí)（如抗體和抗原相互作用），spr特性發(fā)生變化，等離激元共振波長(zhǎng)和相位將發(fā)生偏移。

3、當(dāng)?shù)入x激元納米結(jié)構(gòu)以微納級(jí)間距呈陣列化排布時(shí)，其排列構(gòu)成了類(lèi)似于晶格的結(jié)構(gòu)，此時(shí)會(huì)發(fā)生等離激元表面晶格共振效應(yīng)（surface?lattice?resonance,?slr）。相比spr效應(yīng)，slr會(huì)產(chǎn)生一個(gè)帶寬非常窄（2?nm）的等離激元共振峰，由于slr的窄帶特性，其對(duì)周?chē)肿酉嗷プ饔玫臋z測(cè)靈敏度更高。

4、現(xiàn)有的基于slr效應(yīng)的無(wú)標(biāo)記檢測(cè)生物芯片主要以單純的等離激元納米顆粒陣列為主，其連接吸附的生物分子探針通常是隨機(jī)分布的，存在檢測(cè)效率不穩(wěn)定、器件的一致性和標(biāo)準(zhǔn)化程度低等不足，且等離激元納米結(jié)構(gòu)精度通常在50?nm及以上，限制了光傳感的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了實(shí)現(xiàn)制備低成本、高精度、高靈敏性、可個(gè)性化定制的無(wú)標(biāo)記檢測(cè)生物芯片，本發(fā)明的目的在于提供一種基于等離激元表面晶格共振的dna折紙微陣列生物芯片及其制備方法，其以dna折紙微陣列為基礎(chǔ)，提出了一種從10?nm以下精度的“dna折紙-等離激元納米結(jié)構(gòu)-生物分子探針”組裝體核心單元到微米級(jí)陣列的跨尺度加工?；诘入x激元納米陣列的slr效應(yīng)及集成的生物分子探針（如特異性抗體）與目標(biāo)檢測(cè)物相互作用，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記高靈敏度檢測(cè)。

2、相較于現(xiàn)有技術(shù)，采用dna折紙自組裝技術(shù)構(gòu)筑dna折紙微陣列生物芯片，可通過(guò)自組裝形成10?nm以下精度的等離激元納米結(jié)構(gòu)-生物分子探針單元，每個(gè)陣列單元上都可定制多種生物分子探針（如各種特異性抗體）。這種高精度的dna折紙微陣列生物芯片制造方法經(jīng)濟(jì)高效，提高了無(wú)標(biāo)記檢測(cè)生物芯片的生物化學(xué)特性，并能滿足個(gè)性化的醫(yī)療需求。

3、本發(fā)明的實(shí)施例通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

4、一種基于等離激元表面晶格共振的dna折紙微陣列生物芯片，其整體結(jié)構(gòu)包括兩個(gè)部分：芯片基底和陣列化排布的dna折紙-等離激元納米結(jié)構(gòu)-生物分子探針單元，所述芯片基底為sio2材質(zhì)，其折射率在1.45-1.5之間。

5、進(jìn)一步地，所述芯片基底采用納米球刻蝕技術(shù)進(jìn)行周期性圖案化處理，周期為100-1000?nm，周期數(shù)100-10000量級(jí)，排成六邊形陣列、正方形陣列中的一種。

6、進(jìn)一步地，所述dna折紙由一條長(zhǎng)的dna單鏈（如：長(zhǎng)的腳手架鏈，如m13mp18噬菌體單鏈）和若干短dna單鏈（如：訂書(shū)釘短鏈）通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)折成；其形狀為三角形、四邊形、六邊形、八邊形或圓形中的一種；dna折紙的尺寸在50-300?nm之間。

7、進(jìn)一步地，所述等離激元納米結(jié)構(gòu)為單個(gè)等離激元納米粒子和/或多個(gè)等離激元納米粒子。

8、進(jìn)一步地，所述等離激元納米粒子為金屬納米粒子、雜化金屬納米粒子、雜化金屬-介質(zhì)納米粒子中的一種，其形狀為球型、棒型、正方體型、星型、盤(pán)型、核殼球形結(jié)構(gòu)中的一種。

9、一種基于等離激元表面晶格共振的dna折紙微陣列生物芯片的制備方法，包括以下步驟：

10、步驟一：設(shè)計(jì)dna折紙，在其表面伸出用于抓取并連接一個(gè)或多個(gè)等離激元納米粒子和生物分子探針的a類(lèi)單鏈；

11、步驟二：用與a類(lèi)單鏈堿基互補(bǔ)配對(duì)的b類(lèi)單鏈dna修飾等離激元納米粒子和生物分子探針；

12、步驟三：基底上通過(guò)納米球刻蝕技術(shù)及表面氧氣等離子體處理等工序進(jìn)行圖案化處理，以構(gòu)造形成親水性陣列排布的點(diǎn)位；

13、步驟四：每個(gè)點(diǎn)位上連接dna折紙形成微陣列；具體地，所述點(diǎn)位上通過(guò)mg2+連接帶有羥基的dna折紙形成dna折紙陣列；

14、步驟五：通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)，在dna折紙上精確可控地定位自組裝生物分子探針和等離激元納米粒子，形成等離激元-生物分子探針微陣列，其中生物分子探針和等離激元納米粒子均可為多種，按設(shè)計(jì)的方式組合成單元。

15、更為具體地，其制備方法如下：

16、s1.?將長(zhǎng)序列dna單鏈（腳手架鏈，如m13mp18噬菌體單鏈）與短dna單鏈（訂書(shū)釘鏈）、等離激元納米粒子抓取鏈、生物分子抓取鏈按1:15-25:15-25:15-25的摩爾比混合，在核酸擴(kuò)增儀中加熱至70-90℃，保持5-10分鐘，再?gòu)?5℃退火至25-30℃，最后采用凝膠電泳的方法進(jìn)行純化，緩沖液為0.5×tae-mg2+；

17、s2.?采用sio2基底，用o2等離子體處理，將直徑為500?nm的納米球（如：聚苯乙烯球）沉積在基底上，形成六方密排的單層/多層納米球；然后在真空干燥器中用六甲基二硅氮烷（hmds）溶液對(duì)其進(jìn)行處理，在基底表面添加疏水的三甲基硅烷基；最后通過(guò)在水中超聲處理基底片子，使其表面的納米球脫落，再通過(guò)o2等離子體處理使圓形陣列位點(diǎn)上產(chǎn)生親水性的硅醇基；將dna折紙溶液滴在刻蝕好的陣列上，在濕潤(rùn)的容器中孵育一小時(shí)，使dna折紙連接在親水性位點(diǎn)上，再用含有0.07%的tween-20緩沖液（tris，mgcl2）進(jìn)行多次洗滌，去除多余的dna折紙；

18、s3.?用巰基化單鏈dna（如polyt、ct-9等）修飾等離激元納米粒子（如：金納米球/金納米棒）和生物分子探針（如：特異性igg抗體），并采用凝膠電泳的方法進(jìn)行純化，電泳緩沖液為0.5×tbe；將修飾好的等離激元納米粒子溶液加入上述基底表面的緩沖液，在濕潤(rùn)條件下控制溫度，退火孵育過(guò)夜后，用含有mgcl2的緩沖液洗滌基底表面，去除多余的等離激元納米粒子；再將修飾好的生物分子探針（如：特異性igg抗體）溶液加入基底表面的緩沖液，在37℃條件下孵育1小時(shí)以上，用緩沖液沖洗基底表面；由于dna折紙表面特定位置預(yù)先設(shè)計(jì)好了納米粒子和生物分子的抓取鏈，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)，修飾了互補(bǔ)單鏈dna的等離激元納米粒子和生物分子將會(huì)有效連接在dna折紙上的特定位點(diǎn)，如此形成了“dna折紙-等離激元納米結(jié)構(gòu)-生物分子探針”復(fù)合結(jié)構(gòu)單元。

19、再一方面，本發(fā)明還提供了一種上述生物芯片在生物分子檢測(cè)中的應(yīng)用；具體地，通過(guò)光源發(fā)出的光穿透血液液滴及生物芯片，根據(jù)光電探測(cè)器傳輸及pc端的光譜及共振峰位移分析，可直接獲得生物分子檢測(cè)數(shù)據(jù)。多共振峰位移可協(xié)同作為生物分子檢測(cè)的判斷依據(jù)。

20、本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案至少具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

21、1、本發(fā)明使用dna折紙自組裝技術(shù)構(gòu)造微陣列單元及生物分子探針，使得該生物芯片可以實(shí)現(xiàn)針對(duì)多種或一種病原檢測(cè)的個(gè)性化定制。

22、2、本發(fā)明通過(guò)納米球刻蝕的方式制造陣列化圖案，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)等離激元-生物探針微陣列，成本較低，具有較高可擴(kuò)展性，芯片的器件一致性和標(biāo)準(zhǔn)化程度高。

23、3、本發(fā)明的生物探針集成度高，在毫米級(jí)的范圍內(nèi)高度有序集成百萬(wàn)級(jí)以上的分子探針，僅需50?μl的血液樣本，即可檢出目標(biāo)檢測(cè)物。

24、4、本發(fā)明基于slr效應(yīng)，具有高q值光傳感信號(hào)，可實(shí)現(xiàn)超低濃度檢測(cè)。