本發(fā)明涉及生物傳感器，具體涉及一種納米通道限域的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的適配體傳感器及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、疾病相關(guān)蛋白，特別是對(duì)腫瘤生物標(biāo)志物的檢測(cè)需求日益增長(zhǎng)。癌胚抗原(cea)是一種由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白，常被作為廣譜腫瘤標(biāo)志物，cea的特異性高靈敏測(cè)定對(duì)腫瘤的臨床診斷和療效評(píng)價(jià)具有重要意義。目前，血清中cea的檢測(cè)方法有以下幾種，如安培法、熒光法、電化學(xué)法、光電化學(xué)法、酶聯(lián)免疫吸附分析法和毛細(xì)管電泳法。在這些方法中，抗體主要作為識(shí)別元件。然而，抗體有著易失活、成本高等問(wèn)題。適配體具有與抗體相似的分子識(shí)別特征，其相較于抗體有著成本低、合成簡(jiǎn)單、易修飾等優(yōu)勢(shì)。目前，適配體生物傳感器在腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中展現(xiàn)了巨大的潛力。例如，研究者構(gòu)建了基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的cea核酸適配體傳感器，將氨基修飾的cea適配體共價(jià)標(biāo)記在水溶性paa修飾上轉(zhuǎn)換納米粒子(paa-ucps)上，作為能量供體，實(shí)現(xiàn)了cea高靈敏檢測(cè)。

2、電化學(xué)發(fā)光(ecl)是基于電化學(xué)刺激引發(fā)的高能電子轉(zhuǎn)移的能量弛豫過(guò)程，該分析技術(shù)結(jié)合了電化學(xué)和光學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，具有時(shí)間和空間可控性、高靈敏度和準(zhǔn)確性以及寬線(xiàn)性范圍等優(yōu)點(diǎn)。在ecl傳感領(lǐng)域，基于luminol電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)因其出色的發(fā)光特性和低激發(fā)電位而受到研究人員的青睞。然而，傳統(tǒng)的luminol-h2o2體系通常受到h2o2自分解和易氧化等問(wèn)題的制約，限制了其在生物分析中的應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)一種穩(wěn)定且不需要外部共反應(yīng)物的新型ecl信號(hào)增強(qiáng)方法具有重要意義。

3、石墨烯量子點(diǎn)(gqds)是一種尺寸小于100nm，由單層或少數(shù)石墨烯層構(gòu)成的石墨烯類(lèi)材料，具有高的穩(wěn)定性，大的比表面積和優(yōu)異的催化活性，在傳感、生物成像等領(lǐng)域有著泛的應(yīng)用。納米酶是一種新興的多功能化納米材料，可以模擬天然酶的各種催化特性。然而，在均相溶液中游離分散狀態(tài)的納米酶往往會(huì)存在穩(wěn)定性差和催化活性低等問(wèn)題，將納米酶限域在一個(gè)底物濃縮的密閉環(huán)境，可以最大程度地減少活性中間體的分解，提升其催化活性。

4、luminol的氧化和活性氧(ros)的產(chǎn)生是觸發(fā)luminol?ecl體系的關(guān)鍵。納米酶是一類(lèi)具有類(lèi)似天然酶催化活性和酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征的納米材料，具有制備簡(jiǎn)單、催化活性可調(diào)、穩(wěn)定性高等優(yōu)勢(shì)。其中，擬過(guò)氧化物納米酶可以催化h2o2產(chǎn)生大量的ros，這對(duì)提升luminol體系的ecl信號(hào)是有利的。目前，利用納米酶提升luminol體系ecl信號(hào)已成為研究的熱門(mén)領(lǐng)域之一。然而，在均相體系中，納米酶單獨(dú)的性能并不能滿(mǎn)足信號(hào)放大的要求，分散游離的納米酶導(dǎo)致納米酶及其中間產(chǎn)物(ros)的局部濃度降低，從而限制了擬酶催化過(guò)程的總體有效性。通過(guò)將納米酶固定在載體上或限域在受限空間中，構(gòu)建納米催化反應(yīng)器可以改善酶的穩(wěn)定性和催化性能。因?yàn)檫@種限制可以最大限度地減少活性中間體的分解，同時(shí)也避免納米酶受到反應(yīng)介質(zhì)的影響。

5、介孔二氧化硅納米通道薄膜(snf，也稱(chēng)為垂直有序介孔二氧化硅薄膜vmsf)是一類(lèi)具有高孔密度、均一孔徑、易修飾改性以及良好的機(jī)械和化學(xué)穩(wěn)定性等特性的納米材料。高的孔密度、比表面積賦予了其優(yōu)異的傳質(zhì)能力，為構(gòu)筑門(mén)控型傳感器奠定了基礎(chǔ)。良好的機(jī)械和化學(xué)穩(wěn)定性是snf限域納米酶的前提條件。snf孔道富含具有反應(yīng)活性的硅羥基，可作為共價(jià)修飾的位點(diǎn)，這使在電極表面構(gòu)筑生物識(shí)別界面成為可能。除此之外，snf的良好的防玷污和抗干擾能力，有望在復(fù)雜樣品中實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的防污檢測(cè)。

6、因此，snf可作為一種優(yōu)良的材料限域納米酶，同時(shí)對(duì)其外表面進(jìn)行修飾改性，構(gòu)建生物識(shí)別界面，有望構(gòu)筑高效ecl傳感器用于腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對(duì)魯米諾ecl效率不高、免疫傳感器檢測(cè)靈敏度需進(jìn)一步提高的問(wèn)題，提供一種納米通道限域的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的適配體傳感器，基于snf限域n-gqds納米酶構(gòu)建內(nèi)源性共反應(yīng)劑的門(mén)控型ecl適配體傳感器，極大得增敏了luminol-o2體系的ecl信號(hào)，具有檢出限低，檢測(cè)范圍寬的優(yōu)點(diǎn)。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、一種納米通道限域的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的適配體傳感器，所述適配體傳感器包括適配體電極、參比電極、對(duì)電極的三電極體系，以含有魯米諾的電解質(zhì)溶液為檢測(cè)液；

4、所述適配體電極為限域氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)納米酶的snf修飾電極，經(jīng)共價(jià)固定腫瘤標(biāo)志物適配體并封閉非特異性位點(diǎn)得到。

5、基于snf限域n-gqds納米酶構(gòu)建內(nèi)源性共反應(yīng)劑的門(mén)控型ecl適配體傳感器檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物。在傳統(tǒng)的luminol-h2o2的ecl體系中，共反應(yīng)劑h2o2的穩(wěn)定性較差且室溫下易發(fā)生分解。通過(guò)以luminol為發(fā)光體，溶解氧作為內(nèi)源性的共反應(yīng)物構(gòu)筑了ecl體系。本發(fā)明通過(guò)水熱法制備了具有擬過(guò)氧化物酶活性的碳基納米酶-氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)(n-gqds)，隨后通過(guò)電泳沉積的方式將n-gqds限域在snf修飾電極中。限域的n-gqds納米酶具有較好的穩(wěn)定性和催化活性，對(duì)luminol的氧化起著電催化的作用，對(duì)o2的還原起著酶催化和電催化的雙重作用，極大得增敏了luminol-o2體系的ecl信號(hào)。對(duì)snf外表面進(jìn)行環(huán)氧基團(tuán)改性后共價(jià)固定適配體進(jìn)而獲得ecl適配體傳感器，提高檢測(cè)的便利性，降低檢測(cè)成本，顯著增敏ecl信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度，用于腫瘤標(biāo)志物的高靈敏檢測(cè)，具有檢出限低，檢測(cè)范圍優(yōu)點(diǎn),并且檢測(cè)不需要進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理和分離過(guò)程，降低了檢測(cè)成本，操作簡(jiǎn)單，適合大規(guī)模的應(yīng)用。

6、優(yōu)選地，所述適配體電極制備具體包括步驟：

7、步驟1，將snf修飾電極浸入在含氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)溶液中，電沉積得到限域n-gqds納米酶的電極；

8、步驟2，將限域n-gqds納米酶的電極浸入(3-環(huán)氧丙基)三甲氧基硅烷(gptms)溶液中靜置反應(yīng)，得到環(huán)氧基功能化限域n-gqds的電極；

9、步驟3，將步驟2中的電極使用去離子水沖洗后，將環(huán)氧基功能化限域n-gqds的電極浸入含腫瘤標(biāo)志物適配體的緩沖溶液中孵育，經(jīng)沖洗后浸入牛血清白蛋白溶液中孵育，得到所述適配體電極。

10、本發(fā)明中將利用n-gqds限域在snf的多孔材料中，利用多孔材料進(jìn)行納米材料的限域，可顯著提高納米材料的穩(wěn)定性。此外，多孔材料提供分散空間，可有效增加納米材料的活性位點(diǎn)，進(jìn)而提高其催化活性和穩(wěn)定性。

11、所述氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)以1-氨基芘為碳源在氨水溶液中經(jīng)水熱法合成；石墨烯量子點(diǎn)(gqds)是一種尺寸小于100nm，由單層或少數(shù)石墨烯層構(gòu)成的新型的石墨烯類(lèi)材料，具有高的穩(wěn)定性，大的比表面積和π-π共軛結(jié)構(gòu)及低的生物毒性，在傳感、生物成像等領(lǐng)域有著泛的應(yīng)用。納米酶是一種新興的多功能化納米材料，可以模擬天然酶的各種催化特性。通過(guò)在gqds中引入氮等摻雜原子，可以使其具有納米酶活性。

12、優(yōu)選地，所述含氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)具體制備包括步驟：

13、將1-氨基芘分散在氨水中180-200℃反應(yīng)2?-10h，產(chǎn)物經(jīng)純化得到含氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)。

14、更進(jìn)一步地，所述含氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)具體制備包括步驟：

15、將1-氨基芘(0.5～5mg/ml)加入到氨水(0.05-0.4m)中，超聲分散后，所得混合物加入到反應(yīng)釜的聚四氟乙烯內(nèi)襯中于180-200℃高壓反應(yīng)2?-10h，產(chǎn)物過(guò)濾后透析經(jīng)冷凍干燥得到n-gqds固體。

16、所述含氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)溶液或(3-環(huán)氧丙基)三甲氧基硅烷溶液采用的溶劑為水；

17、所述snf修飾電極中電極為氧化銦錫電極、玻碳電極、氟摻雜氧化錫電極、金電極、絲網(wǎng)印刷電極、石墨電極、碳纖維電極中的任意一種；

18、所述snf修飾電極的制備方法包括通過(guò)電化學(xué)輔助自組裝法、溶液生長(zhǎng)法、兩相分層生長(zhǎng)法、蒸發(fā)誘導(dǎo)自組裝法、π-π作用誘導(dǎo)法、外延生長(zhǎng)法、強(qiáng)磁場(chǎng)法、電場(chǎng)法、有機(jī)溶劑誘導(dǎo)自組裝法中的任意一種方法在電極上生長(zhǎng)二氧化硅納米陣列薄膜。

19、具體地，利用溶液生長(zhǎng)法制備snf修飾電極的方法包括步驟：以十六烷基磺酸鈉(ctab)作為模版表面活性劑，將其溶于水-乙醇溶液中，加入氨水后，加入有機(jī)硅氧烷前驅(qū)體四乙氧基硅氧烷(teos)后獲得生長(zhǎng)snf的前驅(qū)體溶液。將電極插入到前驅(qū)體溶液中，進(jìn)行二氧化硅納米通道薄膜的生長(zhǎng)。待生長(zhǎng)完成，取出電極，用大量去離子水沖洗，氮?dú)獯蹈?，烘箱?00℃下老化過(guò)夜，得到孔道內(nèi)含有膠束(sm)模板的修飾電極。將電極浸于0.1m的hcl-乙醇溶液中攪拌5min可除去膠束，得到孔道開(kāi)放的snf修飾電極。利用easa法制備snf修飾電極的方法包括步驟：以ctab作為模版表面活性劑，將其溶于水溶液中，調(diào)節(jié)ph＝3后，加入有機(jī)硅氧烷前驅(qū)體teos后獲得生長(zhǎng)snf的前驅(qū)體溶液。將電極插入到前驅(qū)體溶液中，在電極上施加負(fù)電壓使水電解，從而在電極表面原位獲得ph梯度，進(jìn)行二氧化硅納米通道薄膜的生長(zhǎng)。待生長(zhǎng)完成，取出電極，用大量去離子水沖洗，氮?dú)獯蹈?，烘箱?00℃下老化過(guò)夜，得到孔道內(nèi)含有sm模板的修飾電極。將電極浸于0.1m的hcl-乙醇溶液中除去膠束，得到孔道開(kāi)放的snf修飾電極。

20、步驟1的含氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)溶液中氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)質(zhì)量濃度為0.1-2.0mg/ml，電沉積時(shí)間為3～12min，電沉積電壓為+0.7v～+0.9v。

21、優(yōu)選地，沉積時(shí)間為4～10min，進(jìn)一步優(yōu)選地，沉積時(shí)間為5-10min；更進(jìn)一步地，電沉積時(shí)間為5-6min，電沉積電壓為+0.8v。

22、步驟2中g(shù)ptms溶液中g(shù)ptms的摩爾濃度為2mm～3mm，靜置反應(yīng)30～60min；靜置反應(yīng)溫度為20～40℃。

23、步驟3中孵育條件為0～5℃孵育30～90min。

24、步驟3中緩沖溶液含腫瘤標(biāo)志物適配體的緩沖溶液中腫瘤標(biāo)志物適配體的摩爾濃度為0.1～0.2μm，緩沖溶液為氯化鈉水溶液、硫酸鈉水溶液、氯化鉀水溶液或磷酸緩沖溶液；緩沖溶液中溶質(zhì)濃度為0.005～0.5mol/l，ph為6～8。

25、所述檢測(cè)液中魯米諾的摩爾濃度為30-80μmol/l。魯米諾濃度過(guò)低時(shí)，電極測(cè)得的ecl信號(hào)較低。溶解氧為內(nèi)源性共反應(yīng)劑。溶解氧普遍存在于生物樣品中，且在溫度和大氣壓一定的情況下，溶解氧濃度基本恒定。此外，電化學(xué)發(fā)光為電極界面反應(yīng)，消耗的僅為電極表面的溶解氧，相對(duì)于本體溶液而言，本體溶液中的溶解氧是過(guò)量的，因此以溶解氧為內(nèi)源性共反應(yīng)劑，可以保證電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的穩(wěn)定性。

26、優(yōu)選地，各步驟在結(jié)束后用水或緩沖液進(jìn)行沖洗，以去除多余未沉積或孵育的溶液；

27、本發(fā)明還提供所述的納米通道限域的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的適配體傳感器的構(gòu)建方法，包括步驟：

28、步驟1，將snf修飾電極浸入在含氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)溶液中，電沉積得到限域n-gqds納米酶的電極；

29、步驟2，將限域n-gqds納米酶的電極浸入(3-環(huán)氧丙基)三甲氧基硅烷(gptms)溶液中靜置反應(yīng)，得到環(huán)氧基功能化限域n-gqds的電極；

30、步驟3，將步驟2中的電極使用去離子水沖洗后，將環(huán)氧基功能化限域n-gqds的電極浸入含腫瘤標(biāo)志物適配體的緩沖溶液中孵育，經(jīng)沖洗后浸入牛血清白蛋白溶液中孵育，得到所述適配體電極；

31、步驟4，以所述適配體電極、參比電極和對(duì)電極的三電極體系，以含魯米諾的電解質(zhì)溶液為檢測(cè)液，構(gòu)建形成所述適配體傳感器。

32、本發(fā)明還提供所述的納米通道限域的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的適配體傳感器在非診斷目的的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用，包括步驟：

33、將適配體電極與含腫瘤標(biāo)志物的待測(cè)樣品溶液孵育后沖洗得到適配體復(fù)合物修飾電極；以適配體復(fù)合物修飾電極為修飾電極，與參比電極、對(duì)電極組成三電極體系，以含有魯米諾的電解質(zhì)溶液為檢測(cè)液進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光信號(hào)檢測(cè)。

34、檢測(cè)原理如下：當(dāng)血清樣本中存在腫瘤標(biāo)志物時(shí)，腫瘤標(biāo)志物適配體與腫瘤標(biāo)志物結(jié)合，結(jié)合在電極界面上的龐大的腫瘤標(biāo)志物適配體會(huì)對(duì)魯米諾的擴(kuò)散傳質(zhì)產(chǎn)生顯著的位阻效應(yīng)，從而改變電極的ecl信號(hào)。因此根據(jù)電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的猝滅程度，可以實(shí)現(xiàn)腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

35、待測(cè)樣品溶液包括含腫瘤標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)溶液或血清樣品。

36、所述待測(cè)樣品中包含葡萄糖、非目標(biāo)腫瘤標(biāo)志物、無(wú)機(jī)鹽中一種或多種干擾化合物。

37、采用所述納米通道限域的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的適配體傳感器在非診斷目的的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中最低檢出限達(dá)到0.44pg?ml-1。

38、該檢測(cè)方法用于非診斷目的的檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物，可研究抗腫瘤適配體應(yīng)答的相關(guān)機(jī)制、檢測(cè)與藥物作用后的殘留腫瘤標(biāo)志等。

39、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

40、(1)本發(fā)明基于snf限域n-gqds納米酶提升luminol-o2體系的ecl信號(hào)構(gòu)建了門(mén)控型ecl傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)cea的檢測(cè)，提升了納米酶穩(wěn)定性的同時(shí)又增強(qiáng)了其催化活性，既能電催化氧化luminol，同時(shí)又能電催化還原o2，進(jìn)而增敏了luminol-o2體系的ecl信號(hào)。同時(shí)納米通道表面豐富的硅羥基賦予其易修飾的特性，經(jīng)環(huán)氧基修飾改性后可構(gòu)筑生物識(shí)別界面。

41、(2)本發(fā)明中n-gqds直接固定在電極上，在電極表面經(jīng)一段時(shí)間后會(huì)發(fā)生團(tuán)聚，呈現(xiàn)均勻分散的梭形結(jié)構(gòu)，而納米通道限域的n-gqds通過(guò)尺寸效應(yīng)被很好的保護(hù)在孔道內(nèi)，因此限域的n-gqds具有穩(wěn)定性強(qiáng)，檢測(cè)時(shí)經(jīng)多次沖洗重復(fù)使用仍具有優(yōu)異的檢測(cè)靈敏度。

42、(3)本發(fā)明基于納米通道限域的n-gqds對(duì)ecl信號(hào)的催化放大和檢測(cè)物結(jié)合到適配體傳感界面上引起的門(mén)控效應(yīng)，構(gòu)筑了ecl適配體傳感器用于高靈敏檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物cea。在納米通道內(nèi)部，受限的空間可以提供更高的表面積，限域的n-gqds具有更多的活性位點(diǎn)和表面反應(yīng)活性，表現(xiàn)出顯著的催化活性，從而增敏了luminol體系的ecl信號(hào)。在納米通道的外表面，以外表面的硅羥基作為活性位點(diǎn)偶聯(lián)環(huán)氧基，利用環(huán)氧基和氨基功能化的適配體之間發(fā)生的開(kāi)環(huán)反應(yīng)構(gòu)筑適配體識(shí)別界面。當(dāng)cea特異性結(jié)合到識(shí)別界面上時(shí)，形成的復(fù)合物降低了luminol向基底電極的擴(kuò)散，基于生物識(shí)別產(chǎn)生的門(mén)控效應(yīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)cea的高靈敏檢測(cè)。所構(gòu)建的適配體傳感器具有制造簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。

43、(4)本發(fā)明的傳感器用于非治療或診斷目的的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)，具有線(xiàn)性范圍寬、制造簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏度高、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)。