本技術(shù)屬于分子生物學(xué)檢測(cè)，更具體地說，涉及一種松材線蟲病的診斷方法及其專用試劑盒。

背景技術(shù)：

1、松材線蟲病(bursaphelenchus?xylophilus)是一種重大的森林病害，對(duì)我國乃至世界生態(tài)環(huán)境和森林資源造成了嚴(yán)重破壞和威脅。自1982年在南京中山陵首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲病以來，目前全國有江蘇、浙江、山東、安徽、福建、廣西、遼寧、天津、四川、湖北等18個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)成為松材線蟲病疫區(qū)。被松材線蟲感染后的松樹，針葉會(huì)逐漸失綠，變?yōu)辄S褐色、紅褐色，部分枝條枯死，直至全株萎蔫。松材線蟲病的致病機(jī)理尚未明確，且防治十分困難，該病一旦發(fā)生，整個(gè)松林將遭受毀滅性破壞。國內(nèi)外對(duì)該病研究多年，主要關(guān)注于對(duì)病原相關(guān)科學(xué)問題的探究，如病原種類、病原致病機(jī)理、病原線蟲生態(tài)學(xué)特性、病原傳播媒介、病害診斷及防治等。由于該病發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜性，病原物的致病機(jī)理尚不十分清楚，目前仍缺少簡(jiǎn)便有效的防治手段。因此，在松樹未表現(xiàn)明顯發(fā)病癥狀時(shí)，若能對(duì)感病松樹進(jìn)行早期的檢測(cè)診斷，是當(dāng)前松材線蟲病防控中急需解決的幾個(gè)關(guān)鍵技術(shù)難題之一。

2、隨著分子植物病理學(xué)的發(fā)展，效應(yīng)子(effector)在病原物致病相關(guān)方面的研究越來越深入。效應(yīng)子是由病原物分泌的、可以改變寄主植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和代謝途徑，從而促進(jìn)對(duì)寄主的成功侵染或者觸發(fā)寄主的防衛(wèi)反應(yīng)的一類外泌型蛋白。其中植物病原細(xì)菌的iii型分泌系統(tǒng)研究最為深入，病原真菌和卵菌的效應(yīng)子功能研究也較為廣泛，而有關(guān)植物寄生線蟲效應(yīng)子的研究多集中于孢囊線蟲(heterodera)和根結(jié)線蟲(meloidogyne)這兩類固著型線蟲。鑒于松材線蟲與松樹互作中會(huì)分泌多種效應(yīng)子參與致病過程，本團(tuán)隊(duì)自2016年開始對(duì)松材線蟲分泌的效應(yīng)子進(jìn)行篩選和功能鑒定，通過利用松材線蟲的基因組和侵染松樹不同階段的轉(zhuǎn)錄組信息，已篩選并陸續(xù)發(fā)現(xiàn)松材線蟲在侵染松樹早期分泌的效應(yīng)子，包括bxsapb1、bxsapb2、bxsapb3、bxcdp1、bxscd1等，初步揭示了它們?cè)谟|發(fā)或抑制植物防衛(wèi)反應(yīng)中的作用。然而效應(yīng)子在早期檢測(cè)松材線蟲病中是否具有應(yīng)用價(jià)值并不清楚，值得探究。

3、以往基于分子生物學(xué)的松材線蟲檢測(cè)方法主要包括限制性片段長度多態(tài)性(rflp)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性dna(rapd)、序列特異擴(kuò)增區(qū)域、巢氏pcr、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(lamp)、重組聚合酶擴(kuò)增(rpa)等，這些方法均是以核酸為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)，需獲得松材線蟲蟲體的dna。然而在實(shí)際發(fā)病明顯的松林中分離到松材線蟲蟲體時(shí)，植株多已相對(duì)處于感病的中期或晚期階段，已喪失治療的窗口期。為進(jìn)一步爭(zhēng)取在侵染初期尚未顯現(xiàn)明顯癥狀的松樹中及時(shí)檢測(cè)到松材線蟲的為害，以掌握治療該病的最佳時(shí)間，需進(jìn)一步開發(fā)更為精準(zhǔn)快速，且無需獲得松材線蟲dna的檢測(cè)技術(shù)。

4、病原物效應(yīng)子是一類分泌型蛋白，已有研究人員利用免疫熒光技術(shù)在番茄、大豆等農(nóng)作物的根系，成功觀察到效應(yīng)子基因的熒光定位，但在林木病害的研究中鮮見報(bào)道。本團(tuán)隊(duì)前期在未檢測(cè)到松材線蟲的松樹組織處，通過熒光定位成功可視化觀察到了松材線蟲的效應(yīng)蛋白。然而該方法尚存在如松木組織軟化難度較高、制片時(shí)間較長等不足，以致于仍無法實(shí)現(xiàn)在松樹感病早期快速檢測(cè)松材線蟲病的目的。elisa抗體夾心法是一種固相酶聯(lián)免疫反應(yīng)，經(jīng)抗原或抗體特異性標(biāo)記物質(zhì)，洗滌和顯色后來檢測(cè)樣本中特定的分子和濃度。該方法更具有操作簡(jiǎn)便，且試驗(yàn)時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)，在動(dòng)物病毒性疾病檢測(cè)中起到重要作用，如非洲豬瘟病毒和狂犬病病毒等。而目前尚未見利用酶聯(lián)免疫技術(shù)早期檢測(cè)林木病原物效應(yīng)蛋白的相關(guān)研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本技術(shù)所要解決的技術(shù)問題在于提供一種松材線蟲病的診斷方法，用于早期檢測(cè)松材線蟲病。本技術(shù)還要解決的技術(shù)問題在于提供一種診斷松材線蟲病的專用試劑盒，用于早期快速檢測(cè)松材線蟲病。

2、為了解決上述技術(shù)問題，本技術(shù)所采用的技術(shù)方案如下：

3、一種松材線蟲病的診斷方法以松材線蟲特異性效應(yīng)蛋白bx-far-1為生物標(biāo)志物；檢測(cè)到植物組織中存在松材線蟲效應(yīng)蛋白bx-far-1，即為該植物材料感染松材線蟲。

4、所述的松材線蟲病的診斷方法，以松材線蟲特異性效應(yīng)蛋白bx-far-1為生物標(biāo)志物制備多克隆抗體；使用多克隆抗體對(duì)植物組織中的松材線蟲進(jìn)行檢測(cè)。

5、所述的松材線蟲病的診斷方法，所述多克隆抗體由多克隆一抗抗體與多克隆二抗抗體組成；所述多克隆一抗抗體，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示；所述多克隆二抗抗體為大鼠mouse?igg2a單克隆抗體。

6、用于診斷松材線蟲病的專用試劑盒，含有bx-far-1純蛋白、bx-far-1蛋白的多克隆抗體。

7、所述的專用試劑盒在診斷松材線蟲病中的應(yīng)用。

8、所述的應(yīng)用，具體步驟包括：

9、1)研磨加樣：取松樹樣品于液氮速凍，將樣品研磨至勻漿狀態(tài)；離心后取松樹樣品上清液加至酶標(biāo)條的樣本反應(yīng)孔中；然后分別向酶標(biāo)條的陰性對(duì)照孔和陽性對(duì)照孔中加入待測(cè)樣品；

10、2)平衡處理：將上述加好的樣品置于室溫下10min做平衡處理；

11、3)抗體孵育：分別向陰性對(duì)照孔、陽性對(duì)照孔和樣本孔中依次加入一抗和二抗，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃恒溫箱放置30min；

12、4)底物顯色：棄去液體，每孔加洗滌液，重復(fù)洗板5次；每個(gè)反應(yīng)孔加入底物溶液a和b各50μl，于37℃恒溫箱放置10min；每孔加入終止液50μl，在450nm波長處測(cè)定各孔的od值；

13、所述試劑盒檢測(cè)到吸光值<測(cè)定數(shù)據(jù)的臨界閾值時(shí)，則樣品中不存在松材線蟲；所述試劑盒檢測(cè)到吸光值>測(cè)定數(shù)據(jù)的臨界閾值時(shí)，則樣品中存在松材線蟲。

14、所述的應(yīng)用，所述測(cè)定數(shù)據(jù)的臨界閾值＝陰性對(duì)照的平均值+0.15。

15、松材線蟲效應(yīng)蛋白bx-far-1在制備診斷松材線蟲病的專用試劑盒中的應(yīng)用。

16、松材線蟲效應(yīng)蛋白bx-far-1的多克隆抗體在制備診斷松材線蟲病的專用試劑盒中的應(yīng)用。

17、相比于現(xiàn)有技術(shù)，本技術(shù)的有益效果為：

18、1)本技術(shù)研發(fā)創(chuàng)制了松材線蟲特異性效應(yīng)蛋白bx-far-1的酶聯(lián)免疫試劑盒。該試劑盒以檢測(cè)病原物分泌的特異蛋白為目標(biāo)，通過判斷效應(yīng)蛋白的有無以實(shí)現(xiàn)對(duì)病原松材線蟲的檢測(cè)，無需依靠松材線蟲的核酸樣本，可在蟲體未到達(dá)且外觀未表現(xiàn)明顯癥狀的松樹部位實(shí)現(xiàn)對(duì)松材線蟲的檢測(cè)。

19、2)本技術(shù)公開的elisa試劑盒操作簡(jiǎn)便，取樣后無需分離線蟲，整體檢測(cè)時(shí)長約為1h，能夠及時(shí)掌握該病防治的窗口期，為早期檢測(cè)松材線蟲病的發(fā)生提供了重要依據(jù)和技術(shù)支撐。

20、3)本技術(shù)采用的bx-far-1蛋白為松材線蟲的特異性效應(yīng)蛋白，經(jīng)ncbi數(shù)據(jù)庫檢索，未在其他物種(尤其是植物寄生線蟲)中檢測(cè)到該蛋白，同時(shí)，在傘滑刃屬線蟲中也未檢測(cè)到bx-far-1的同源蛋白序列。因此，本技術(shù)以松材線蟲效應(yīng)蛋白bx-far-1為生物標(biāo)志物，進(jìn)行松材線蟲病的檢測(cè)，具有非常好的特異性。