本發(fā)明涉及納米酶，具體制備了au/co/hofs（ach）納米酶，該材料具有良好的類過氧化物酶活性，對草甘膦可進行特異性識別，通過構(gòu)建比色傳感器用于特異性檢測草甘膦的殘留。

背景技術(shù)：

1、草甘膦（glyphosate，glp）是一種非選擇性、系統(tǒng)和廣譜吸收的有機磷類除草劑，具有高除草活性，是全球最廣泛應(yīng)用的除草劑之一。許多研究表明，glp是一種潛在的內(nèi)分泌干擾物，可能通過受污染的飲用水和農(nóng)產(chǎn)品對人類產(chǎn)生毒理學(xué)作用，通過凋亡和自噬誘導(dǎo)細胞死亡來影響細胞周期調(diào)控。近年來，隨著glp的消耗量急劇增加，引發(fā)了人們對其潛在健康和環(huán)境危害的擔(dān)憂。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)（gb2763-2021）《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》已經(jīng)確定了glp在食物樣品中的最大殘留限量（mrl）范圍為0.1~5?mg/kg。因此，監(jiān)測谷類、水果、蔬菜和飲用水中的glp濃度具有重要意義。

2、傳統(tǒng)的glp檢測方法有高效液相色譜法（hplc）、離子色譜法（ic）、質(zhì)譜法（ms）、液相色譜-質(zhì)譜（lc-ms）和離子色譜-高分辨率質(zhì)譜（ic-hrms）等。這些方法靈敏度較高，但其樣品制備過程復(fù)雜，依賴于昂貴的儀器和熟練的技術(shù)人員。

3、目前，許多新興的快速檢測技術(shù)如電化學(xué)、比色、熒光法已被開發(fā)用于glp殘留檢測。

4、已經(jīng)公開檢測草甘膦農(nóng)藥的相關(guān)專利中，cn115266702a一種具有仿生酶活性的納米材料的制備方法及該納米材料在草甘膦檢測中的應(yīng)用。該方法通過庚酸和普魯士藍修飾的fe3o4納米顆粒合成了一種具有過氧化物酶樣活性的納米酶(fe3o4@c7/pb)，相比于fe3o4@c7的過氧化物酶樣活性更高，且fe3o4@c7/pb可以通過單層pb保持穩(wěn)定，以防止凝聚。但該方法操作復(fù)雜，檢測成本高，有待進一步改善。

5、cn202211598906?一種基于紅外光增強缺陷納米酶快速檢測草甘膦的方法。本發(fā)明提供了一種基于紅外光增強缺陷納米酶快速檢測草甘膦的方法，該方法合成了鉬、磷摻雜四氧化三鐵（fe3o4/mo/p）納米酶，產(chǎn)生豐富的缺陷位點，提高fe3o4/mo/p納米酶的結(jié)合能力和催化活性，在紅外光作用下，該納米酶活性得到進一步提高?；诓莞熟⑻禺愋缘匚接趂e3o4/mo/p粗糙表面，從而抑制該納米酶的催化活性，可建立了草甘膦的快速檢測方法。然而該方法線性范圍較窄。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種基于比色傳感器用于草甘膦農(nóng)藥的特異性檢測方法。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于如何解決現(xiàn)有的草甘膦檢測方法操作復(fù)雜、特異性差、檢測時間長的問題。本發(fā)明制備的au/co/hofs（ach）納米酶，具有良好的類過氧化物酶活性，對草甘膦可進行特異性識別。擺脫了傳統(tǒng)傳感器需要精密儀器、專業(yè)操作人員、測試條件苛刻的限制，大大縮短了檢測時間。

2、實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是：

3、一種納米酶在特異性檢測草甘膦中的應(yīng)用，所述納米酶為基于au/co/hofs制備而成的ach納米酶，其中，“a”代表金納米粒子au?nps，“co”代表co2+，h代表由1,3,6,8-四-(對胺基苯基)-芘pytta自組裝形成的氫鍵有機骨架hofs；

4、經(jīng)實驗研究，ach納米酶表現(xiàn)出類過氧化物酶活性，引發(fā)3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺氧化為藍色產(chǎn)物，從而傳遞比色信號；

5、用ach納米酶檢測草甘膦，?co2+與草甘膦配位更強，使co2+脫離了hofs，從而使材料失去過氧化物模擬酶活性，因此可用于特異性檢測草甘膦。

6、具體地，用ach納米酶結(jié)合比色法可檢測水樣和油菜中草甘膦，檢測方法包括以下步驟：

7、步驟a：將tris-hcl、一定濃度的ach和不同濃度glp在一系列離心管中混合后在20-50℃下孵育10~45?min；

8、步驟b：將tmb和h2o2加入步驟a中對應(yīng)的離心管，繼續(xù)在20~50℃下孵育10~45?min；

9、步驟c：將步驟b中孵育后的溶液加入96孔板，用酶標(biāo)儀測定其od值；

10、步驟d：利用實驗組和對照組的差值與glp的濃度做線性回歸曲線；

11、對照組glp濃度為0?ng/ml；

12、測定水樣和油菜中的草甘膦時，用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定水樣和油菜，配制含有0.02、20、200?μg/ml的glp待測樣。

13、進一步的，步驟a中，?tris-hcl的體積為1~3000?μl，濃度為0.00001~10?mol/l；

14、ach?的體積為1~30?μl，濃度為0.001~10?μg/ml；

15、glp的體積為1~1000?μl，濃度為0.01~1000000?ng/ml；

16、步驟b中，tmb的體積為1~3000?μl，濃度為0.001~10?μg/ml；

17、h2o2?的體積為1~3000?μl，濃度為0.001~10?μg/ml。

18、本發(fā)明ach納米酶的制備方法，包括如下步驟：

19、步驟1：取1,3,6,8-四-(對胺基苯基)-芘（pytta）完全溶解于n,?n-二甲基甲酰胺（dmf）中，將溶解后的溶液緩慢滴加在攪拌的水中，攪拌反應(yīng)；

20、步驟2：在攪拌下，向步驟1的溶液中緩慢加入無水乙醇，繼續(xù)攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用無水乙醇和水分別離心洗滌，最后分散于水中，即制得hofs溶液；

21、步驟3：取n-（4-氨基丁基）-n-乙基異魯米諾（abei）和haucl4·4h2o混合后，攪拌使其混合均勻，再加入co(ch3coo)2和步驟2制得的hofs溶液，繼續(xù)攪拌，攪拌后產(chǎn)物用水離心洗滌，洗滌后分散在水中，即制成ach納米酶。

22、進一步地，步驟1中pytta與dmf的用量比為1~100?mg:1~1000?ml；

23、攪拌反應(yīng)時間為2~50?min；

24、步驟2中無水乙醇的加入量為10~100?ml；

25、攪拌反應(yīng)時間為2~50?min；

26、步驟3中abei和haucl4·4h2o的用量比為1?ml:1~10?ml；

27、co(ch3coo)2和hofs溶液的加入量為1?ml:1~10?ml；

28、abei的濃度為0.00001-0.04?mol/l；

29、haucl4?4h2o的濃度為0.00001-0.05?mol/l；

30、hofs溶液的濃度為0.0001-0.25?g/ml；

31、co(ch3coo)2的濃度為0.00001-1?mol/l；

32、abei和haucl4·4h2o混合后，攪拌1~6?h；

33、加入co(ch3coo)2和hofs溶液，繼續(xù)攪拌1~16?h；

34、步驟1、2和3中，攪拌轉(zhuǎn)速為20~14000?rpm/min。

35、制備時，可按所述制備方法中原料配比的倍數(shù)添加各原料。

36、本發(fā)明au/co/hofs（ach）納米酶的制備方法，將au還原在hofs表面，利用hofs上豐富的氨基通過配位作用將co2+限制在hofs中，合成了ach納米酶。該納米酶可以催化h2o2產(chǎn)生ros使無色的tmb氧化成藍色的oxtmb且glp對ach納米酶的催化活性有抑制作用，從而構(gòu)建了一種用于glp特異性檢測的比色傳感方法。