本發(fā)明涉及電化學(xué)發(fā)光傳感器，具體涉及一種zn-mof@ru/mip電化學(xué)發(fā)光傳感器及其制備方法和應(yīng)用以及采用該傳感器對(duì)藥物卡托普利進(jìn)行可視化檢測(cè)的方法。
背景技術(shù)：
：：1、藥物成像技術(shù)是一種基于分子影像學(xué)的新興技術(shù)，通過分子顯影和成像系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)人體內(nèi)藥物分布、代謝和藥效狀態(tài)的實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，為臨床治療提供了一種更為準(zhǔn)確、及時(shí)、全面的診斷和治療手段。卡托普利(captopril,ctp)，是首個(gè)獲批的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑類藥物，對(duì)多種類型高血壓均有明顯降壓作用，但其過度使用可導(dǎo)致腎損傷和腎衰竭。因此，建立一種簡(jiǎn)單快捷、精確靈敏的卡托普利測(cè)定方法，指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。目前主要采用比色法、電化學(xué)法、熒光法和液質(zhì)聯(lián)用法等方法測(cè)定卡托普利，但目前這些方法還無法進(jìn)行藥物成像檢測(cè)。藥物成像技術(shù)可用于原位分析藥物及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的分布，可視化藥物與靶分子之間的相互作用，研究藥物的藥理活性，并進(jìn)行藥物篩選。因此，開發(fā)一種簡(jiǎn)單快捷、經(jīng)濟(jì)高效、設(shè)備便攜的方法用于快速成像檢測(cè)ctp非常有價(jià)值。2、電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ecl)，是通過化學(xué)反應(yīng)將輸入的電能轉(zhuǎn)化為光能輸出的過程。由于能量形式的轉(zhuǎn)變，賦予了該方法背景信號(hào)接近零、靈敏度高、時(shí)空分辨率高等優(yōu)點(diǎn)。近年來，研究者將電化學(xué)發(fā)光與光學(xué)顯微技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建了電化學(xué)發(fā)光顯微鏡(electrochemiluminescence?microscopy,eclm)。傳統(tǒng)的eclm裝置成本較高、不易組裝，在一定程度上阻礙了該技術(shù)的推廣。目前eclm已被廣泛應(yīng)用于研究機(jī)理路徑，細(xì)菌、細(xì)胞及細(xì)胞器成像、單顆粒示蹤、單分子成像、蛋白質(zhì)電暈形成動(dòng)力學(xué)和單細(xì)胞定量分析等領(lǐng)域。但目前還未見有基于eclm的藥物成像定量方法。3、引入具有特定識(shí)別能力的功能單元可以提高藥物成像定量分析的選擇性。分子印跡聚合物(molecularly?imprinted?polymer,mip)是一種人工受體，去除模板后可在聚合物中形成具有特定識(shí)別位點(diǎn)的空腔。它們具有理化性質(zhì)穩(wěn)定，合成過程簡(jiǎn)單，成本低，選擇性好，通用性好，結(jié)構(gòu)可預(yù)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。本技術(shù)發(fā)明人團(tuán)隊(duì)以甲基丙烯酸為單體，通過tg-cnnss與分子印跡聚合物結(jié)合，構(gòu)建得到用于檢測(cè)秋水仙堿的電化學(xué)發(fā)光傳感器(wu?y,qind,luo?z,hu?s,xu?l,deng?b.construction?of?a?smartphone-basedelectrochemiluminescence?imaging?device?to?guide?the?improvement?of?sensingperformance?via?surface?regulation[j].sensors?and?actuators?b:chemical,2023,389:133885.)；同時(shí)本技術(shù)發(fā)明人團(tuán)隊(duì)利用該電化學(xué)發(fā)光傳感器與自研的基于智能手機(jī)的eclm(smartphone-based?eclm,seclm)，期望實(shí)現(xiàn)對(duì)秋水仙堿的可視化檢測(cè)，但并未實(shí)現(xiàn)。本技術(shù)發(fā)明人分析，可能是因?yàn)閠g-cnnss的ecl強(qiáng)度不夠。4、金屬有機(jī)框架(metal-organic?framework,mof)是一種結(jié)構(gòu)和尺寸可調(diào)控、孔隙率優(yōu)良、比表面積大的多孔材料，已被應(yīng)用于傳感器、催化和藥物遞送等領(lǐng)域。目前，mof在eclm中的應(yīng)用有待發(fā)展。但目前還未見有采用以ctp為模版，zn-mof@ru結(jié)合mip構(gòu)建用于ctp藥物成像的可視化檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種具有優(yōu)異電化學(xué)發(fā)光性能和連續(xù)激發(fā)重復(fù)性的zn-mof@ru/mip電化學(xué)發(fā)光傳感器及其制備方法和應(yīng)用以及采用該傳感器對(duì)藥物卡托普利進(jìn)行可視化檢測(cè)的方法。2、本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種zn-mof@ru/mip電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法，具體是在電極的表面滴涂zn-mof@ru水溶液，晾干，在zn-mof@ru層表面滴涂成膜劑溶液，待其干燥成膜后在膜表面滴涂含有以卡托普利為模板的分子印跡聚合物的溶液，晾干，即得到所述的zn-mof@ru/mip電化學(xué)發(fā)光傳感器；其中，zn-mof@ru為鋅基金屬有機(jī)框架-三(2,2′-聯(lián)吡啶基)釕復(fù)合物。3、本技術(shù)中，zn-mof@ru/mip表示鋅基金屬有機(jī)框架-三(2,2′-聯(lián)吡啶基)釕分子印跡復(fù)合物。涉及的zn-mof@ru具體是三(2,2′-聯(lián)吡啶基)釕(tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium,ru-bpy)嵌入鋅基金屬有機(jī)框架(zinc-based?metal-organic?framework,zn-mof)得到的復(fù)合材料，可采用現(xiàn)有常規(guī)方法進(jìn)行制備，如參考現(xiàn)有文獻(xiàn)(zhao?g,wang?y,lix,yue?q,dong?x,du?b,cao?w,wei?q.dual-quenching?electrochemiluminescencestrategy?based?on?three-dimensional?metal–organic?frameworks?forultrasensitive?detection?of?amyloid-β[j].analytical?chemistry,2019,91:1989–1996.)進(jìn)行制備。涉及的以卡托普利為模板的分子印跡聚合物采用現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行制備，如參考現(xiàn)有文獻(xiàn)(zhang?y,cui?y,sun?m,wang?t,liu?t,dai?x,zou?p,zhao?y,wang?x,wangy,zhou?m,su?g,wu?c,yin?h,rao?h,lu?z.deep?learning-assisted?smartphone-basedmolecularly?imprinted?electrochemiluminescence?detection?sensing?platform:protabledevice?and?visual?monitoring?furosemide[j].biosensors?andbioelectronics,2022,209:114262.)進(jìn)行制備。4、上述zn-mof@ru/mip電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法中，zn-mof@ru水溶液的濃度通常限定為1～3mg/ml。該方法中，涉及的晾干是指在室溫下自然晾干，涉及的干燥成膜是指在室溫下自然干燥成膜。5、上述zn-mof@ru/mip電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法中，涉及的成膜劑為殼聚糖或nafion溶液。當(dāng)成膜劑為殼聚糖時(shí)，成膜劑溶液為殼聚糖的水溶液，基于殼聚糖在水中的溶解性較差，因此選擇在酸性條件下對(duì)其進(jìn)行溶解，此時(shí)，成膜劑溶液優(yōu)選為濃度為0.1～0.3wt％的殼聚糖水溶液(溶劑水的ph＝3～5，用乙酸或其他常規(guī)酸進(jìn)行調(diào)節(jié))。當(dāng)成膜劑為nafion溶液時(shí)，成膜劑溶液優(yōu)選為濃度為0.05～0.1wt％的nafion溶液。6、上述zn-mof@ru/mip電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法中，所述的含有以卡托普利為模板的分子印跡聚合物的溶液，是以水為溶劑、以卡托普利為模板的分子印跡聚合物為溶質(zhì)，加入適量成膜劑配制而成。該溶液中成膜劑的選擇及其在溶液中的濃度如前所述。對(duì)于滴涂于膜表面的含有以卡托普利為模板的分子印跡聚合物的溶液的量，具體是以負(fù)載于電極上的以卡托普利為模板的分子印跡聚合物的量為要求，申請(qǐng)人的試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)所用電極的直徑為3mm時(shí)，電極上負(fù)載的以卡托普利為模板的分子印跡聚合物的量?jī)?yōu)選為12～15μg，更優(yōu)選為14μg。對(duì)于含有以卡托普利為模板的分子印跡聚合物的溶液的濃度沒有特別要求，優(yōu)選為1～3mg/ml。7、上述zn-mof@ru/mip電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法中，所述的電極可以是玻碳電極、金電極、鉑電極、氧化銦錫電極或氟化氧化銦錫電極，優(yōu)選為玻碳電極。所述電極的規(guī)格可根據(jù)需要進(jìn)行選擇，通常采用直徑為1～10mm的電極，優(yōu)選采用直徑為3～10mm的電極。8、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供由上述方法制備得到的zn-mof@ru/mip電化學(xué)發(fā)光傳感器。申請(qǐng)人的試驗(yàn)表明，該傳感器表現(xiàn)出優(yōu)異的發(fā)光性能和重復(fù)性。9、本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述zn-mof@ru/mip電化學(xué)發(fā)光傳感器在藥物卡托普利成像檢測(cè)中的應(yīng)用。10、本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供采用上述zn-mof@ru/mip電化學(xué)發(fā)光傳感器對(duì)藥物卡托普利進(jìn)行可視化檢測(cè)的方法，包括以下步驟：11、1)以電化學(xué)工作站作為電壓源、正置顯微鏡作為放大工具、智能手機(jī)作為圖像捕獲工具，在正置顯微鏡下方設(shè)置反應(yīng)池，反應(yīng)池中填充檢測(cè)溶液，反應(yīng)池中設(shè)置有與電化學(xué)工作站電連接的工作電極、參比電極和對(duì)電極，構(gòu)建得到三電極系統(tǒng)；其中，工作電極為上述zn-mof@ru/mip電化學(xué)發(fā)光傳感器，工作電極的設(shè)置位置為正對(duì)于正置顯微鏡物鏡的中心，檢測(cè)溶液由ph＝7.2～8.0的pbs緩沖液和共反應(yīng)劑組成，所述共反應(yīng)劑在檢測(cè)溶液中的濃度為1.15～1.3mmol/l；12、2)在工作電極的表面滴涂檢測(cè)樣本，孵育完成后用水沖洗，干燥后置于反應(yīng)池中進(jìn)行成像檢測(cè)，即可獲得樣本中卡托普利的光學(xué)圖像；當(dāng)檢測(cè)樣本中卡托普利的濃度不在檢測(cè)線性范圍內(nèi)時(shí)，先用稀釋劑稀釋，所述的稀釋劑為ph＝4.5～5.2的pbs緩沖液。13、上述方法的步驟1)中，構(gòu)建得到的三電極系統(tǒng)與本技術(shù)人之前研究成果(wu?y,qin?d,luo?z,hu?s,xu?l,deng?b.construction?of?a?smartphone-basedelectrochemiluminescence?imaging?device?to?guide?the?improvement?of?sensingperformance?via?surface?regulation[j].sensors?and?actuators?b:chemical,2023,389:133885.)中公開的成像裝置相似，除采用工作電極不同，其他均相同。構(gòu)建的三電極系統(tǒng)中，通常采用ag/agcl電極作為參比電極，鉑電極作為對(duì)電極。工作電極在正置顯微鏡的下方且正對(duì)于正置顯微鏡物鏡的中心，在具體進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，根據(jù)類似于載玻片原理，調(diào)節(jié)正置顯微鏡物鏡與工作電極的距離直至在目鏡下能夠觀察到清晰成像的位置。該步驟中，所述的共反應(yīng)劑可以是三丙胺或水合二肼，優(yōu)選為三丙胺。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，檢測(cè)溶液由ph＝7.4的pbs緩沖液和共反應(yīng)劑組成，其中共反應(yīng)劑在檢測(cè)溶液中的濃度為1.2mmol/l。從降低拍攝背景干擾的角度考慮，優(yōu)選是將正置顯微鏡放置于暗盒中。14、上述方法的步驟2)中，孵育在室溫條件下進(jìn)行時(shí)，申請(qǐng)人的試驗(yàn)結(jié)果顯示，在前述限定條件下，隨著孵育時(shí)間的增加，猝滅效率逐漸升高后基本不變，在5min時(shí)達(dá)到最高，說明5min的孵育足以讓藥物與mip充分結(jié)合。因此，在室溫條件下的孵育時(shí)間優(yōu)選是大于或等于5min。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，稀釋劑為ph＝5的pbs緩沖液。15、采用上述方法在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，激發(fā)電位設(shè)置為1.2v，曝光時(shí)間設(shè)置為10s，感光度(iso)設(shè)置為6400。16、進(jìn)一步的，還可以將上述獲得的光學(xué)圖像(圖片)通過軟件處理，以獲得圖片的灰度值用以成像定量分析(如通過image?j軟件(版本：1.53t，national?institutes?ofhealth,usa)處理，以獲得red通道的平均灰度值(mean?gray?value)用以成像定量分析)。更為具體的，將獲得的圖片的灰度值作為縱坐標(biāo)，以該圖片灰度值所對(duì)應(yīng)的卡托普利濃度作為橫坐標(biāo)作出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，然后根據(jù)對(duì)檢測(cè)樣本進(jìn)行檢測(cè)獲得的光學(xué)圖像的灰度值找到對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)，從而確定檢測(cè)樣本中藥物卡托普利的濃度。17、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的zn-mof@ru/mip電化學(xué)發(fā)光傳感器表現(xiàn)出優(yōu)異的發(fā)光性能和重復(fù)性(φecl＝306％,rsd＝4.0％)，將其與以ctp為模板的分子印跡聚合物構(gòu)建后可用于藥物卡托普利的成像檢測(cè)，zn-mof@ru為成像裝置提供了足夠強(qiáng)的ecl信號(hào)，以ctp為模板的mip與ctp特異性結(jié)合，保證了傳感器的高選擇性。另一方面，ctp在電極表面的成功可視化檢測(cè)為eclm的藥物成像提供了一個(gè)成功范例，為藥物影像檢測(cè)提供了一個(gè)新方法，有望在藥代動(dòng)力學(xué)、藥物分子動(dòng)態(tài)過程、藥物作用機(jī)制和藥物毒理學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，為促進(jìn)藥理學(xué)研究及藥物篩選提供新策略。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12