本發(fā)明涉及一種應(yīng)用于植物組織中微塑料的快速分離提取方法，屬于環(huán)境污染物分析檢測。

背景技術(shù)：

1、微塑料是一種直徑小于5mm的塑料顆粒，是一種造成污染的主要載體。土壤微塑料污染問題是目前研究的熱點，現(xiàn)有研究表明，微塑料在土壤環(huán)境中無處不在，對土壤生態(tài)的威脅逐漸加重，土壤是植物生長的根本，人們也越來越重視微塑料污染對人體健康的危害。

2、一般來說，微塑料是指粒徑小于5mm的塑料顆粒，主要有顆粒、纖維、薄膜、碎片等不同形態(tài)，包括原生微塑料和次生微塑料，原生微塑料是指工業(yè)生產(chǎn)的小粒徑塑料產(chǎn)品，如化妝品等含有的塑料微珠以及作為工業(yè)原料的塑料顆粒和樹脂顆粒。次生微塑料是指大的塑料垃圾經(jīng)過物理、化學和生物風化過程造成分裂，體積減小而形成的粒徑較小的微塑料。其中進入土壤環(huán)境中的微塑料會通過復雜的物理化學作用改變土壤的理化性質(zhì)(如土壤容重、滲透性、持水量以及水穩(wěn)性團聚等)和生物功能等，從而嚴重影響植物的生長。研究發(fā)現(xiàn)，微塑料可以被植物吸收，還可通過土壤動物和微生物的攝取而進入食物鏈中并進一步傳遞遷移，進而對更廣泛的生命體造成不可估量的影響。在這一過程中，微塑料主要通過食物鏈進行傳播，植物會通過毛孔吸附、胞吞和蒸騰作用等將土壤環(huán)境中的微塑料顆粒攝入體內(nèi)。這些微塑料的聚集、含量和分布研究是目前的熱點。對于植物組織樣本中微塑料的檢測，通常是先通過消解法去除有機質(zhì)的干擾，將有機質(zhì)體內(nèi)的微塑料顆粒釋放出來，再通過浮選、過濾、密度分離等方法將微塑料顆粒與樣品基質(zhì)分離，最后再借助特殊儀器對微塑料進行分析檢測，確定微塑料的種類和豐度。然而植物組織的木質(zhì)部結(jié)構(gòu)、高纖維素含量和蛋白質(zhì)等均對微塑料的分離提取具有較大的限制。目前尚無統(tǒng)一、成熟的植物組織中微塑料分離、提取和純化方法，不同的方法可能導致結(jié)果差異。這在一定程度上限制了對微塑料的分析。所以需要研究開發(fā)出一種應(yīng)用于植物組織中微塑料的快速分離提取方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的主要目的在于，提供一種能對植物體內(nèi)的微塑科進行快速分離、富集提純、經(jīng)濟實用、對環(huán)境友好，對微塑料無損、高效的應(yīng)用于植物組織中微塑料的快速分離提取方法。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：

3、一種用于植物組織中微塑料的快速分離提取方法，其特征在于：主要包括步驟如下：

4、步驟一：對采集的植物組織樣本進行去除表面附著物的預處理

5、(1)采集待檢測的植物組織樣本，用超純水清洗樣品三次，確保清洗干凈后，向處理后的植物組織樣本中加入無水乙醇沒過樣本，置于加熱爐上，在59.5℃-60.5℃下加熱29.5-30.5min，隨后連同濾液一同過濾到濾膜上，使用無水乙醇將濾膜上的樣本沖洗至燒杯中，重復三次，隨后使用鋁箔紙包裹樣本，置于烘箱中，在59.5℃-60.5℃下自然烘干1.9-2.1h，得到去除表面附著物的干凈的植物組織樣品；

6、(2)根據(jù)植物組織部位的不同，將烘干后的植物組織樣品切碎至粒徑≤2mm，隨后稱取10mg樣品，置于消解瓶中，等待消解；

7、步驟二：配置芬頓消解液

8、(1)配置質(zhì)量百分比濃度2.78％的feso4溶液：使用稀鹽酸將50ml超純水的ph調(diào)至3.01～3.14，隨后用萬分之一天平稱量1.39g硫酸亞鐵固體，加入其中，攪拌，獲得50ml2.78％的feso4溶液；

9、(2)混合、配置芬頓消解液：向消解瓶中加入150ml質(zhì)量百分比濃度30％h2o2溶液，隨后使用移液器加入500μl?2.78％的feso4溶液，二者體積比為1：300，隨后立即搖晃消解瓶，使得feso4和h2o2均勻混合，得到芬頓消解液；

10、步驟三：植物組織樣本芬頓氧化消解和還原劑還原

11、(1)將消解瓶置于搖床中，在60℃、115rpm和72w全光譜光照的條件下消解2～2.5h，確認植物組織完全消解后，將消解瓶置于冰水混合物中終止消解反應(yīng)；

12、(2)向終止反應(yīng)后的消解瓶中加入15g?l-抗壞血酸固體，隨后置于搖床中，搖床溫度設(shè)置為60℃、轉(zhuǎn)速為115rpm，振蕩，消解瓶內(nèi)放置溫度計，時刻控制還原反應(yīng)溫度，當溫度高于60℃時，將消解瓶置于冰水混合物中1～2s，隨后繼續(xù)振蕩30～40min，確認消解液變澄清后，將消解液過濾到孔徑為100nm的濾膜上，用超純水反復沖洗過濾器3次以上，沖洗液一并過濾到濾膜上，至此，植物組織樣品中的微塑料得以分離提取至濾膜上；

13、步驟四：采用體視鏡對干燥后的濾膜進行顯微觀察，獲取濾膜上微塑料的形狀、尺寸、表明紋理特征和位置，隨后將濾膜移至顯微拉曼光譜儀下，根據(jù)體視鏡下確定的位置，獲取對應(yīng)微塑料的拉曼光譜，將獲取的拉曼光譜與標準微塑料譜庫進行匹配度對比，匹配度高于80％的判斷為微塑料。

14、作為優(yōu)選：步驟一中所述植物組織包括花卉、農(nóng)作物、水生植物中的一種和多種；所述植物組織樣品包括植物組織的葉片、果實、根、莖部中的一種和多種。

15、作為優(yōu)選：步驟一中所述無水乙醇的濃度為75％；濾膜孔徑為20μm。

16、作為優(yōu)選：步驟三(1)光照條件的添加方式為，在搖床箱蓋內(nèi)安裝四條250cm長的全光譜燈條，作用功率為72w。

17、作為優(yōu)選：步驟三(2)中所述的冰水混合物中冰和水的質(zhì)量比例為250g：300g～350g：300g。

18、在本發(fā)明用于土壤環(huán)境中微塑料的高效分離提取實驗方法的研制過程中，申請人主要做了以下工作：

19、1、芬頓試劑配比、外加條件及后續(xù)還原條件的確定：根據(jù)芬頓試劑的配比原理，我們確定了芬頓試劑最佳反應(yīng)比為1：300，因為消解液顏色在1：300最淺、在2～3h內(nèi)都維持淺色，說明此時溶液內(nèi)部鐵離子含量并不多，芬頓反應(yīng)處于fe2+高于h2o2的情況，反應(yīng)持續(xù)穩(wěn)定進行，氫氧根在2～3h內(nèi)穩(wěn)定產(chǎn)生，且整體反應(yīng)在2～3h內(nèi)處于前中期情況，不會進入后期，這不僅僅保證了氫氧根的穩(wěn)定生成，同時也保證了植物組織被完全消解，在此比例下，芬頓試劑的溫度可控；進一步的，我們發(fā)現(xiàn)，在芬頓反應(yīng)中，提高溫度、振蕩和提供光照可以很明顯的提高反應(yīng)速率，為了保證微塑料不被消解液所影響，我們根據(jù)近年來發(fā)表的植物、動物及土壤中微塑料的提取方法文獻，最終設(shè)定消解瓶溫度控制在60℃、搖床轉(zhuǎn)速115rpm、給予全光譜光照的外加條件，在此條件下，基于先前的芬頓試劑配比，我們不僅保證了消解后不會影響微塑料的形狀、尺寸、表明紋理特征以及拉曼光譜檢測識別率，而且可以實現(xiàn)快速消解，85-100min內(nèi)即可完全消解10mg的植物組織樣品，這比以往的任何一種植物體內(nèi)微塑料提取方法都要快速高效，并且是對微塑料本身無影響的；由于芬頓試劑在消解完成后會產(chǎn)生較多的鐵化合物沉淀，影響后續(xù)微塑料的分離鑒定，因此采取添加還原劑的方法去除消解液中的鐵化合物，為保證后續(xù)廢液對環(huán)境污染小，采用添加15g?l-抗壞血酸的方法，還原反應(yīng)和芬頓氧化反應(yīng)的條件類似，同樣采取消解瓶溫度控制在60℃、搖床轉(zhuǎn)速115rpm的外加條件，使用冰水混合物對消解瓶進行控溫，實現(xiàn)30min完全澄清消解液，至此，植物組織內(nèi)微塑料分離提取可在2h內(nèi)完成。同時，基于我們的芬頓試劑配比和后續(xù)還原劑的添加配比，我們使用的過氧化氫和硫酸亞鐵比工業(yè)芬頓試劑要少得多得多，并且在后續(xù)處理中，本發(fā)明添加的還原劑l-抗壞血酸也是一種低廉、對環(huán)境友好的還原劑，添加量也較少，因此該消解方法是經(jīng)濟、快速、高效且對環(huán)境友好的。

20、2、芬頓試劑對微塑料質(zhì)量、表面形貌、熒光強度和光譜識別率的影響驗證：為了驗證芬頓試劑對微塑料表面形貌、重量和光譜數(shù)據(jù)是否有影響，需要用到六種微塑料標準品，高密度聚乙烯(hdpe)、低密度聚乙烯(ldpe)、聚丙烯(pp)和聚對苯二甲酸乙二醇酯(pet)，以及可生物降解塑料聚乳酸(pla)和聚己二酸丁二醇酯-對苯二甲酸丁二醇酯(pbat)，其中不可降解聚合物分別對應(yīng)著農(nóng)田土壤中含量最高的四種微塑料，全生物降解聚合物目前已在農(nóng)業(yè)種植中廣泛應(yīng)用的全生物降解地膜的兩種原材料。這些標準微塑料造粒產(chǎn)品都購買于石河子開發(fā)區(qū)西府眾信包裝制品有限公司，粒徑皆在2-3mm之間。試驗驗證前，先使用顯微拉曼光譜儀進行分析，不可降解聚合物的鑒定匹配率均超過95％。微塑料標準品是購買于中國廣州市中新塑料有限公司的0.4-0.5mm粒徑大小的顆粒狀微塑料。各類微塑料的信息見表1。

21、表1本方法中所使用的微塑料標準品相應(yīng)的類型、形狀、尺寸、來源及密度(g·cm-3)

22、

23、

24、本發(fā)明的優(yōu)點在于：

25、本發(fā)明提供了一種能對植物體內(nèi)的微塑科進行快速分離、富集提純、經(jīng)濟實用、對環(huán)境友好，對微塑料無損的高效分離提取實驗方法，可在85min內(nèi)將10mg植物組織的有機質(zhì)完全消解，且不會損壞微塑料的結(jié)構(gòu)，可應(yīng)用于各種植物組織中微塑料的快速分離提取。