本發(fā)明涉及熒光檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測中樞神經(jīng)維生素b12缺乏癥羥鈷胺受體抗體的熒光檢測試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、維生素b12是一種必需的水溶性微量營養(yǎng)素，參與新陳代謝過程。維生素b12在神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能中起到重要作用，通過參與髓鞘合成，同時(shí)在骨髓中促使紅細(xì)胞的成熟，對循環(huán)系統(tǒng)也具有影響。缺乏維生素b12可能導(dǎo)致神經(jīng)功能缺陷，包括協(xié)調(diào)性變差、痙攣和認(rèn)知功能下降。然而，依賴血液中b12的檢測無法準(zhǔn)確反映大腦中的水平。

2、cd320，也稱為轉(zhuǎn)鈷胺素受體，在血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞中富集，并介導(dǎo)轉(zhuǎn)鈷胺素結(jié)合的維生素b12進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)胞作用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，b12缺乏癥患者的免疫球蛋白抑制cd320功能，抗cd320可能通過減少細(xì)胞表面受體的可用性來阻礙維生素b12穿過血腦屏障的運(yùn)輸。在血液中檢測到抗cd320抗體陽性可預(yù)測腦內(nèi)維生素b12缺乏。cd320自身抗體可能通過首先減少腦內(nèi)維生素b12水平，進(jìn)而對腦內(nèi)神經(jīng)產(chǎn)生影響。對于抗cd320血清陽性且具有不明原因的神經(jīng)系統(tǒng)異常的患者，考慮檢測腦脊液中維生素b12代謝物。

3、檢測cd320抗體的存在有助于診斷維生素b12缺乏相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，并指導(dǎo)臨床治療。然而，目前缺乏高效、快速的檢測cd320抗體的方法和試劑盒。因此，開發(fā)一種高靈敏度、高特異性的檢測試劑盒具有重要的臨床意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于目前缺乏高效快速的cd320抗體檢測試劑盒，本發(fā)明旨在提供一種靶向cd320抗體試劑盒。本發(fā)明還提供了一種檢測患者血清或腦脊液中抗羥鈷胺受體自身抗體的新方法，通過制備攜帶cd320基因載體的細(xì)胞，結(jié)合高靈敏度的細(xì)胞免疫熒光檢測技術(shù)。使該方法具有高檢測效率和強(qiáng)特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

2、本發(fā)明利用細(xì)胞免疫熒光(cba)技術(shù)，結(jié)合抗原與抗體的特異性結(jié)合特性，并且在檢測過程中未對樣品中的抗原或抗體進(jìn)行修飾或固定，充分保留了它們的空間結(jié)構(gòu)，從而提高了檢測的靈敏度和特異性。

3、具體而言，本發(fā)明通過多段重組方法將cd320基因重組至pires2-egfp載體中。該載體保留了egfp蛋白功能，同時(shí)避免對目的基因功能的影響。該載體便于檢測轉(zhuǎn)染是否成功，確保cd320基因高質(zhì)量表達(dá)，從而產(chǎn)生足夠的cd320蛋白，用于檢測樣品中的抗cd320抗體。

4、為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用于檢測抗cd320抗體的檢測試劑盒。該試劑盒包括表達(dá)cd320基因的細(xì)胞、第二抗體；其中第二抗體是抗人抗體，與第二抗體接觸時(shí)，會(huì)產(chǎn)生熒光或發(fā)生熒光淬滅。

5、本發(fā)明中，待測樣品中含有的cd320抗體為第一抗體，能夠與本發(fā)明試劑盒中所表達(dá)cd320基因的細(xì)胞產(chǎn)生的cd320蛋白發(fā)生抗原-抗體特異性結(jié)合。所述第一抗體(抗體性抗原)又能夠與試劑盒中所述第二抗體發(fā)生抗原-抗體特異性結(jié)合。

6、作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述第二抗體包括但不限于山羊、大鼠、小鼠、驢、馬、兔、狗、牛等抗人抗體；優(yōu)選山羊抗人抗體，其來源包括但不限于市售或者實(shí)驗(yàn)室制備。

7、作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述第二抗體類型包括但不限于igg、igm、iga、igg(fc)等，優(yōu)選igg。

8、作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述表達(dá)cd320細(xì)胞為轉(zhuǎn)有攜帶cd320基因表達(dá)pires2-egfp載體的細(xì)胞。

9、作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述表達(dá)cd320基因的細(xì)胞制備方法包括：

10、cd320基因載體構(gòu)建；

11、準(zhǔn)備293t細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染；

12、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞；

13、作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述cd320基因載體構(gòu)建步驟包括：通過pcr方法擴(kuò)增得到片段pcr產(chǎn)物，通過多段充足的方法重組到目的載體中，最終得到目標(biāo)質(zhì)粒。

14、作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述cd320基因載體構(gòu)建進(jìn)一步包括：人體cd320基因的全長序列盒所述載體用限制性內(nèi)切酶酶切后連接的步驟，所述限制性內(nèi)切酶為xhol-bamhi酶切。在所述cd320基因載體構(gòu)建質(zhì)粒的步驟中，使用pcr法獲取所述cd320基因，在所述pcr法中使用的引物對的序列為g0294965-1_1所示序列和g0294965-1_2所示序列。

15、作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞包括但不限于hek293t，cho，hela，human?es細(xì)胞，mc3t3-e1等；優(yōu)選hek293t，進(jìn)一步優(yōu)選經(jīng)過傳代貼壁生長的hek293t。

16、作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法包括但不限于電擊法，脂質(zhì)體介導(dǎo)法，病毒介導(dǎo)法，顯微注射法，磷酸鈣法，基因槍法等；優(yōu)選脂質(zhì)體介導(dǎo)法。

17、作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中轉(zhuǎn)染使用脂質(zhì)體為陽離子脂質(zhì)體；優(yōu)選lipofectamine3000。

18、作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中包括加入質(zhì)粒和脂質(zhì)體。

19、作為本發(fā)明提供的試劑盒可用于制備一種檢測患者血清或腦脊液中抗羥鈷胺受體自身抗體的檢測方法的試劑，檢測方法包括：

20、步驟1樣品處理：收集患者樣品，按照1:10，1:32，1:100，1:320的比例用稀釋液稀釋；

21、步驟2接種所述表達(dá)cd320基因的細(xì)胞；

22、步驟3加入封閉液，37℃孵育30分鐘；

23、步驟4加入待測樣品，37℃孵育1小時(shí)；

24、步驟5洗滌后加入二抗，37℃孵育30分鐘；

25、步驟6洗滌后，通過所述檢測細(xì)胞和所述待測樣品產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，診斷是否患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)b12缺乏癥。

26、作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述步驟1中樣品包括但不限于血清和腦脊液；優(yōu)選血清。

27、作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述步驟2中進(jìn)一步包括：用1ml胰酶消化hek293t細(xì)胞1-2分鐘，用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基重懸hek293t細(xì)胞。將細(xì)胞懸液置于96孔板，孔板置于37℃，5％二氧化碳、飽和濕度下的孵育箱中孵育8-24小時(shí)后，細(xì)胞完全貼壁后開始轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)有cd320基因質(zhì)粒的hek293t細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)24小時(shí)，顯微鏡下觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率達(dá)到60％-80％時(shí)，用于后續(xù)檢測。

28、作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述封閉液包括山羊血清，牛血清白蛋白，脫脂奶粉，市售封閉液等，優(yōu)選山羊血清。

29、作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述洗滌液包括不限于pbs，市售洗滌液等，優(yōu)選pbs。

30、作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述步驟5中進(jìn)行反應(yīng)的二抗為熒光標(biāo)記山羊抗人抗體。

31、作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述步驟6進(jìn)一步包括以陰性和陽性樣品作為對照，在顯微鏡視野下根據(jù)熒光信號強(qiáng)弱診斷是否患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)b12缺乏癥。

32、本發(fā)明還提供一種cmv-cd320-pires-egfp基因載體質(zhì)粒構(gòu)建方法，用于制備所述的用于檢測抗cd320抗體的熒光檢測試劑盒，包括如下步驟：

33、步驟一、通過pcr法，獲得擴(kuò)增cd320片段，所用引物為：

34、上游引物的堿基序列為堿基序列表中seq?id?no.1的堿基序列：

35、tcagatccgctagcgctaccggactcagatctcgagatgagcggcggttggatggcgcaggttggagcgtgg；

36、下游引物的堿基序列為堿基序列表中seq?id?no.2的堿基序列：

37、taacgttaggggggggggagggagaggggcggatcctcacttgt?catcgtcgtccttgtaat；

38、步驟二、菌液pcr方法篩選陽性克隆，獲得陽性菌液37℃搖菌提質(zhì)粒，經(jīng)測序?qū)Ρ日_的質(zhì)粒，用xhol-bamhi進(jìn)行雙酶切。

39、一種轉(zhuǎn)有cd320基因質(zhì)粒的hek293t轉(zhuǎn)染細(xì)胞的獲得方法，用于制備所述的用于檢測抗cd320抗體的熒光檢測試劑盒，包括如下步驟：

40、1)細(xì)胞培養(yǎng)：hek293t細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)，置于含有10％滅活胎牛血清的dmem培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)；

41、2)細(xì)胞復(fù)蘇和傳代：預(yù)先向50ml離心管中加入20ml?dmem培養(yǎng)基，從液氮罐取出凍存細(xì)胞立刻放入37℃水浴中解凍，用70％酒精消毒凍存管外壁厚，將細(xì)胞儲(chǔ)存液轉(zhuǎn)移至離心管中，100rmp離心5分鐘后棄上清，重懸細(xì)胞置于含10％胎牛血清dmem培養(yǎng)基中，37℃，5％二氧化碳、飽和濕度下的孵育箱培養(yǎng)；

42、3)細(xì)胞準(zhǔn)備：用1ml胰酶消化hek293t細(xì)胞1-2分鐘，用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基重懸hek293t細(xì)胞；將細(xì)胞懸液置于96孔板，孔板置于37℃，5％二氧化碳、飽和濕度下的孵育箱中孵育8-24小時(shí)后，細(xì)胞完全貼壁后開始轉(zhuǎn)染；

43、4)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：取無菌1.5mlep管，加入無血清dmem培養(yǎng)基，將權(quán)利要求8制備的質(zhì)粒和lipofectamine3000充分混勻，靜置15-20分鐘；將混合液加入上述準(zhǔn)備的細(xì)胞中，置于含5％二氧化碳的37℃孵育箱中孵育。

44、本發(fā)明的有益效果為：

45、本發(fā)明提供了一種用于檢測抗cd320抗體的熒光檢測試劑盒及其制備方法，能夠高效準(zhǔn)確地檢測患者血清或腦脊液中抗cd320抗體的存在及濃度。試劑盒通過特異性抗體與表達(dá)cd320基因的細(xì)胞產(chǎn)生的cd320蛋白結(jié)合，再與熒光標(biāo)記的第二抗體結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號，從而實(shí)現(xiàn)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)b12缺乏癥的診斷。本技術(shù)中的堿基序列確保了cd320基因的有效表達(dá)，對于提高檢測的靈敏度和特異性至關(guān)重要。

46、該試劑盒具有高靈敏度和特異性，操作流程簡便，通過標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)步驟降低了操作難度，提高了檢測效率。此外，第二抗體的選擇靈活多樣，可根據(jù)實(shí)際需求選擇不同動(dòng)物來源的抗人抗體，增強(qiáng)了試劑盒的適應(yīng)性和靈活性。本發(fā)明不僅適用于診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)b12缺乏癥，還可以擴(kuò)展到其他需要檢測抗cd320抗體的領(lǐng)域，為臨床診斷和科學(xué)研究提供了有力的支持。

47、本發(fā)明通過細(xì)胞免疫熒光技術(shù)，建立高靈敏性檢測樣品中cd320抗體的方法，用于臨床定性及cd320自身抗體滴度測定。才用高靈敏度和特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)該染色法(cba)檢測技術(shù)，不需要對抗原和抗體進(jìn)行化學(xué)修飾和固定，能更好的保留抗原和抗體的空間結(jié)構(gòu)。

48、通過與現(xiàn)有的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)、放射免疫沉淀法(ripa)、免疫印跡等檢測方法比較，確定本cba檢測技術(shù)具有靈敏度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，成功解決傳統(tǒng)檢測方法如elisa等常見的假陽性或假陰性，具有十分重要的臨床價(jià)值。