本發(fā)明涉及納米材料和生物傳感，特別涉及一種基于納米材料表面直接吸附的免疫檢測方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、貴金屬納米材料因其獨特的局域等離激元共振特征在光學超材料、傳感、催化及生物醫(yī)學等諸多領(lǐng)域都具有潛在應(yīng)用。酶聯(lián)免疫吸附試驗（elisa）是一種廣泛應(yīng)用于生物標志物檢測的技術(shù)，其靈敏度和特異性使其在臨床診斷和生物醫(yī)學研究中具有重要價值。近年來，貴金屬納米顆粒因其獨特的催化特性和優(yōu)異的光學特性，逐漸成為elisa技術(shù)中的一種新興材料。貴金屬納米顆粒不僅可以作為天然酶的載體，從而增強檢測信號；還可以作為顯色劑，通過其聚集或組裝引起顯著的顏色變化，進一步實現(xiàn)對特定生物標志物的檢測。此外，貴金屬納米顆粒作為納米酶展現(xiàn)出類似于酶的催化活性，推動了納米酶-elisa（nlisa）中的應(yīng)用探索。

2、在傳統(tǒng)的elisa模型中，由于鏈霉親和素（sa）和生物素的結(jié)合力（1015?m-1）遠大于抗體與抗原的特異性結(jié)合力（108?~1012?m-1），sa-生物素親和系統(tǒng)（abc）被廣泛應(yīng)用于免疫檢測信號放大系統(tǒng)。牛血清白蛋白（bsa）通常作為辣根過氧化物酶（hrp）酶標體系的封閉劑。在這一過程中，首先在固相載體上進行sa的鋪板和bsa的封閉，然后連接生物化抗體，作為捕獲目標分子的基礎(chǔ)。在夾心法elisa中，sa與hrp的復合物構(gòu)建為酶標二抗，進一步與生物化抗體結(jié)合，以實現(xiàn)目標分子的檢測。

3、將上述成熟策略借用到nlisa中，建立abc-nlisa，代表了納米科技在免疫檢測領(lǐng)域的一項重要應(yīng)用。盡管將納米酶應(yīng)用于elisa以替代傳統(tǒng)的辣根過氧化物酶（hrp）展現(xiàn)出廣闊的前景，但目前仍面臨多重挑戰(zhàn)。例如，納米酶的催化活性可能因表面修飾而受到影響。此外，將識別抗體共價結(jié)合到納米酶表面通常需要復雜的化學修飾和交聯(lián)步驟，比如首先通過帶羧基末端的巰基化聚乙二醇對其表面進行修飾，隨后采用碳二亞胺法共價連接sa，最后與生物素化抗體結(jié)合以建立abc-nlisa。盡管該方法具有高的靈敏度，但復雜的化學修飾流程、共價連接試劑的篩選以及該納米結(jié)構(gòu)不易用普通uv-vis等儀器表征，仍然一定程度上限制了貴金屬納米酶作為免疫檢測通用模型的廣泛應(yīng)用。通過將抗體等具有識別功能的蛋白以直接吸附的方式參與nlisa無疑是簡便的策略，然而較高的背景信號限制了貴金屬納米酶在更低檢測限要求體系的應(yīng)用。

4、總之，納米酶技術(shù)在nlisa中的應(yīng)用尚處于早期探索階段，且商業(yè)化進程相對緩慢。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)普適的策略，以簡化納米酶的表面修飾過程，并確保其催化活性，從而推動其在nlisa檢測中的廣泛應(yīng)用。這將為免疫檢測技術(shù)的普及與發(fā)展提供新的機遇。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種基于納米材料表面直接吸附的免疫檢測方法及其應(yīng)用，從而解決現(xiàn)有技術(shù)中貴金屬納米酶存在的化學修飾流程復雜、共價連接試劑的篩選過程繁瑣以及不易采用普通uv-vis等儀器進行結(jié)構(gòu)表征的問題。

2、為了解決上述問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種基于納米材料表面直接吸附的免疫檢測方法，所述免疫檢測方法包括：以鏈霉親和素為識別蛋白直接吸附在貴金屬納米顆粒表面，以牛血清白蛋白為封閉蛋白，將貴金屬納米顆粒模擬納米尺度的微孔板進行鋪板和免疫檢測，構(gòu)建納米酶聯(lián)免疫吸附測定模型，實現(xiàn)對目標分子的特異性識別和檢測。

4、根據(jù)本發(fā)明，所述方法包括以下步驟：s1，鋪板-納米顆粒表面修飾：通過種子生長法合成貴金屬納米顆粒，將鏈霉親和素（sa）和牛血清白蛋白（bsa）以一定比例共同吸附到貴金屬納米顆粒表面，孵育一段時間后，將該sa/bsa-貴金屬納米顆粒復合物離心，最后分散在高濃度封閉劑中待用；s2，檢測-elisa模型典型運用：運用夾心法elisa模型檢測目標抗原樣品，加入步驟s1中封閉后的sa/bsa-貴金屬納米顆粒復合物，以增強特異性和降低背景干擾，繪制給定抗原樣品濃度的標準曲線，以驗證靈敏度。

5、優(yōu)選地，步驟s1中，所述貴金屬納米顆粒為核殼納米結(jié)構(gòu)，以金為核，金屬殼層包括：鈀、鉑等。并不局限于形貌，可以是納米棒，也可以是納米球。

6、在本發(fā)明中，為了增加酶和酸性底物的親和力，我們選取帶負電的表面包覆層，如聚苯乙烯磺酸鈉（pss）和介孔二氧化硅（sio2）。優(yōu)選地，納米顆粒包括但不限于介孔二氧化硅包覆的金核鈀殼納米棒（au@pd@sio2）和金核鉑殼納米棒（au@pt@sio2）。

7、優(yōu)選地，步驟s1中，所述的蛋白質(zhì)孵育溫度和孵育時間可根據(jù)需要設(shè)定。優(yōu)選地，所述孵化溫度為4?°c~37?°c，孵育過夜或更長時間。優(yōu)選溫度為4?°c，時間為16?h。

8、在本發(fā)明中，所述sa和bsa，在特定的緩沖環(huán)境中能保持穩(wěn)定。優(yōu)選地，選用tris-hcl（10?mm，ph?=?9.0）或pbs（10?mm，ph?=?7.4）緩沖液。

9、優(yōu)選地，步驟s1中，將納米顆粒分散在三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液（tris-hcl，10?mm，ph?=?9.0）作為孵育液。

10、優(yōu)選地，所述封閉劑為含有bsa和pbst的混合溶液，優(yōu)選地，bsa范圍為0.1%~2%，優(yōu)選地，0.5%（w/v，即5?mg/ml）分散在磷酸鹽吐溫緩沖液（pbst，10?mm，ph?=?7.4）緩沖液中作為封閉濃度。

11、優(yōu)選地，步驟s1中，通過調(diào)節(jié)鏈霉親和素和牛血清白蛋白的共孵比例，可實現(xiàn)對檢測靈敏度的有效調(diào)控。

12、優(yōu)選地，步驟s1中，作為識別蛋白的鏈霉親和素，能捕獲生物化抗體，所述鏈霉親和素的濃度不宜過高，可以為0.5~2.0?μg/ml，優(yōu)選地，0.5、1、1.5和2?μg/ml等，進一步優(yōu)選地，鏈霉親和素的濃度為1?μg/ml。

13、優(yōu)選地，步驟s1中，作為封閉蛋白的牛血清白蛋白，能抑制鏈霉親和素的非特異性吸附和穩(wěn)定其空間結(jié)構(gòu)，所述牛血清白蛋白的濃度為5~50?μg/ml。優(yōu)選地，5、10、20、30、40和50?μg/ml等，進一步優(yōu)選地，牛血清白蛋白的濃度為10?μg/ml。

14、優(yōu)選地，步驟s1中，所述離心條件為12000?rpm，5min。

15、根據(jù)本發(fā)明，提供了一種基于sa和bsa直接吸附的abc-nlisa普適性模型，所述方法操作步驟簡單，反應(yīng)條件溫和，并且所用試劑廉價無毒。

16、根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選方案，選用人il-6作為目標抗原檢測的實施例，實現(xiàn)跟hrp商用試劑盒相似的靈敏度和lod值，證明該nlisa模型的實用性和靈敏性。應(yīng)當理解的是，基于生物素可修飾不同抗體的通用性，該elisa模型也通用，只需改變目標抗原和對應(yīng)抗體，納米顆粒依然作為類酶參與最后的顯色反應(yīng)，在不同抗原檢測模型中可通用。因商用試劑盒鋪板過程的濃度未知，此處提供自鋪板的操作明細。所述方法包括以下步驟：

17、1）用碳酸鈉緩沖液（50?mm，ph?=?9.6）配制il-6捕獲抗體10?μg/ml，按每孔100?μl加入到孔板中，置于4?℃冰箱至少12?h。用pbst（10?mm，ph?=?7.4，下同）清洗三次；

18、2）按每孔300?μl加入1%?bsa-pbst（w/v）溶液，37?℃放置2?h，用pbst洗滌三次；

19、3）將300?pg/ml人il-6抗原用含0.1%?bsa的pbst稀釋至相應(yīng)濃度，按每孔100?μl加入抗原，37?℃反應(yīng)1.5?h，再用pbst洗滌三次；

20、4）按每孔100?μl加入5?μg/ml生物素標記抗體，37?℃反應(yīng)1?h，再用pbst洗滌三次；

21、5）按每孔100?μl加入0.2?nm備用的sa/bsa-貴金屬納米顆粒復合物，37?℃反應(yīng)0.5?h，再用pbst（10?mm，ph?=?7.4）洗滌五次，用pbs（10?mm，ph?=?7.4）洗滌三次；

22、6）nlisa顯色液為1?mm?tmb、1m?h2o2和50?mm?hac的混合液。按每孔50?μl加入顯色劑，37?℃反應(yīng)20?min后，再按每孔100?μl加入2?m?h2so4，終止反應(yīng)，讀取450?nm處的od吸收值。

23、本發(fā)明中，發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)sa和bsa這兩種蛋白質(zhì)的共孵過程對最終的檢測靈敏度有顯著影響。已有報道根據(jù)金納米棒lspr相對位移變化可以計算得到蛋白表觀結(jié)合常數(shù)（ka）。在本發(fā)明中，基于蛋白質(zhì)分子量相似、吸附相同表面的情況下，根據(jù)ka的大小調(diào)整sa和bsa這兩種蛋白質(zhì)的比例，即可實現(xiàn)靈敏度的提高。

24、本發(fā)明中，具體地，在研究直接吸附時，我們對每個樣本體系選取抗原濃度在0和300?pg/ml時讀取od450（分別記作od0，od300），用來探討非特異性吸附和靈敏度。所述步驟包括以下部分：1）通過種子生長法合成貴金屬納米顆粒，將sa和bsa以一定比例共同吸附到納米顆粒表面，孵育一段時間；2）將該復合物離心，最后分散在高濃度封閉劑中待用。

25、以在au@pt@sio2體系為例，優(yōu)選地，加入10?μg/mlbsa和1?μg/mlsa的混合液，即bsa:sa為10:1時，od0（<?0.2）有較低的空白背景，同時od300達到相對最高（~1.5）。但是應(yīng)當理解的是，bsa與sa共孵的優(yōu)化比例是根據(jù)蛋白質(zhì)在表面配體層的結(jié)合常數(shù)和信噪比共同決定，并不是任意尺寸的納米顆粒體系都是該最優(yōu)比例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實際情況進行調(diào)節(jié)。

26、本發(fā)明中，根據(jù)sa和bsa在直接吸附過程的比例可以調(diào)控檢測靈敏度。sa的結(jié)合力很強，帶來的非特異性吸附也明顯。為了更好地促進sa和生物化抗體結(jié)合，孵化過程引入bsa。bsa蛋白作為封閉劑，與識別蛋白共孵，促進其空間結(jié)構(gòu)和吸附狀態(tài)穩(wěn)定性。bsa不僅阻隔納米顆粒與酶標板的接觸，還能抑制sa的非特異性吸附。

27、本發(fā)明中，納米酶表面的共價修飾策略需要篩選合適，表面的封閉策略常用peg，阻止蛋白在表面非特異性吸附，但是由于表面位點封閉抑制了納米酶的活性。然而，在本發(fā)明中，通過物理吸附過程，bsa和sa的吸附不會封閉納米酶的活性位點，不影響納米酶的活性，另外，通過緩沖液環(huán)境以及納米酶金屬組分的調(diào)控能夠增強納米酶的活性。

28、本發(fā)明中，催化活性的保證與合成批次的穩(wěn)定性密切相關(guān)，貴金屬納米酶合成的可控性且能長期穩(wěn)定，nlisa檢測重復性有一定的技術(shù)支撐。

29、本發(fā)明中，調(diào)控環(huán)境ph在封閉劑bsa等電點（pi?=?4.7）附近，隨著緩沖液離子強度的增加，顯色越明顯，靈敏度隨之提高。利用蛋白結(jié)構(gòu)變得松散性，降低底物的擴散勢壘。優(yōu)選地，醋酸鹽緩沖液中反應(yīng)（ph?=?4.5），緩沖液濃度為10?mm~200?mm，如10?mm、20?mm、30mm、40?mm、50?mm等，進一步優(yōu)選50?mm。

30、本發(fā)明中，納米顆粒與蛋白吸附的復合物顆粒濃度要合適，優(yōu)選地，0.1?nm~0.5nm，如0.1?nm、0.2?nm、0.3?nm、0.4?nm、0.5?nm等；進一步優(yōu)選顆粒濃度為0.2?nm。

31、本發(fā)明中，人il-6捕獲抗體和sa分別在聚苯乙烯微孔板和貴金屬納米顆粒表面4oc隔夜包被，再都經(jīng)過bsa封閉步驟和免疫反應(yīng)過程。

32、根據(jù)本發(fā)明的第二方面，還提供一種基于上述免疫檢測方法構(gòu)建的nlisa試劑盒。

33、在nlisa中，貴金屬納米酶被設(shè)計為模擬hrp的過氧化物酶活性，通過表面修飾策略，本發(fā)明首次提出包被和封閉“納米尺度微孔（nanowell）”的概念。具體而言，貴金屬納米酶表面模擬傳統(tǒng)elisa中酶標板的固相載體（如聚苯乙烯微孔板）。通過sa與納米酶復合物的形成和bsa的封閉，建立前期nanowell封閉和鋪板步驟，隨后連接生物素化標記抗體，實現(xiàn)對目標分子的特異性識別。本發(fā)明的發(fā)明點之一主要在于合成一種貴金屬納米顆粒復合物，其作用跟hrp一樣，作為顯色反應(yīng)步驟的催化劑，有效提高電子轉(zhuǎn)移效率，增強化學反應(yīng)的靈敏度和信號強度，且催化活性相比hrp靈活可調(diào)。復合物在體系中是取代親和素包覆的hrp，鏈霉親和素包覆的納米酶，經(jīng)bsa封閉后的表面，將其通過生物素的橋梁效應(yīng)固定在板面上，降低了非特異性吸附，同時納米酶的性質(zhì)又在靈敏度得到體現(xiàn)。

34、nlisa中sa和bsa是通過物理吸附納米酶表面，方法和過程相對簡單，易于操作和大規(guī)模生產(chǎn)。但往往相比于共價修飾，其吸附狀態(tài)有無法確定的不足。本發(fā)明利用金納米球（auns）的粒徑變化和金納米棒（aunr）的縱向表面等離激元共振（lspr）特性，表征蛋白質(zhì)包覆后的吸附特征。具體而言，結(jié)合常數(shù)是描述蛋白質(zhì)與其配體相互作用強度的重要參數(shù)。通過動態(tài)光散射（dls）和紫外-可見光光譜（uv-vis）測試，分別測量了蛋白質(zhì)與納米顆粒吸附前后粒徑和lspr峰位變化，并計算得出蛋白質(zhì)的表觀結(jié)合常數(shù)。借用這一方法可實現(xiàn)對蛋白質(zhì)吸附結(jié)合力的有效評估。這為nanowell包被和封閉時的狀態(tài)衡量奠定理論依據(jù)。

35、此外，本發(fā)明還研究發(fā)現(xiàn)，在形成該復合物的過程，sa與bsa的共同包被對檢測靈敏度影響有利，我們可以根據(jù)兩種蛋白在配體表面吸附的結(jié)合常數(shù)進行優(yōu)化，從而實現(xiàn)低非特異性吸附與高特異性識別兼具的納米酶“鋪板”設(shè)計。本發(fā)明的發(fā)明點主要在于通過優(yōu)化合成一種具有類酶活性的納米顆粒復合物，納米顆粒與鏈霉親和素通過直接吸附也能構(gòu)建abc-nlisa的高靈敏模型。這種創(chuàng)新性的設(shè)計思路為納米酶在elisa中的應(yīng)用提供了新的可能性，推動了該領(lǐng)域的研究進展。

36、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

37、1）簡便性和實用性：本發(fā)明提供一種提高免疫檢測靈敏度的方法，其特征在于使用bsa蛋白作為封閉劑，與識別蛋白共孵育，二者的協(xié)同效應(yīng)對檢測靈敏度有利，比如共孵時bsa對sa吸附行為有抑制sa非特異性吸附的積極影響；調(diào)節(jié)bsa等電點處的離子強度，可促進顯色反應(yīng)靈敏度的提升；無需高濃度納米顆粒的情況下，因而降低成本，這些均表明基于此簡單的修飾方法和表征手段，貴金屬納米酶與sa構(gòu)建酶標二抗具有簡便操作性和實用性；

38、2）親和體系的普適性：鏈霉親和素-生物素體系便于修飾，適用于不同目標分子的檢測，結(jié)合貴金屬納米顆粒的lspr特性，實現(xiàn)簡單的光譜監(jiān)測，提升了靈敏度、適用性和操作簡便性；

39、3）nlisa商用試劑盒研發(fā)：免疫體系中蛋白質(zhì)均采用物理吸附的方式，首次提出基于nlisa體系的納米尺度微孔板設(shè)計理念，采用納米尺寸的包被和封閉策略，簡化樣品制備步驟，顯著降低非特異性吸附，提供貴金屬納米顆粒在免疫檢測試劑盒中的商業(yè)化應(yīng)用潛力。

40、綜上所述，本發(fā)明公開了一種具有簡便性、實用性、普適性的提高免疫檢測靈敏度的方法，開發(fā)了貴金屬納米顆粒在免疫檢測試劑盒中的商業(yè)化應(yīng)用潛力。