一種管內(nèi)固相微萃取技術(shù)用于牛奶中磺胺類抗菌藥的快速檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及磺胺類抗菌藥的檢測方法，特別是涉及一種采用管內(nèi)固相微萃取-毛 細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測聯(lián)用技術(shù)檢測磺胺類抗菌藥的分析方法，屬于分析化學(xué)-食 品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 磺胺類抗菌藥是一類具有廣譜抗菌活性的化學(xué)藥物（SAs)，被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè) 上細(xì)菌感染性疾病的預(yù)防和治療，低劑量使用還可促進(jìn)畜禽生長。但過度使用該類藥物會 導(dǎo)致動物性食品的藥物殘留，甚至?xí)疬^敏反應(yīng)和癌變，進(jìn)而危害人類的健康。為保證人 類的食品安全，許多國家對食品中SAs的殘留制定了最高允許量，我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《動物 性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定磺胺類藥物在動物源性食品中的最高殘留限量（MRLs)為 100ug/kg。因此，磺胺類抗菌藥的檢測對食品安全的質(zhì)量監(jiān)控至關(guān)重要。
[0003] 目前用于磺胺類抗菌藥的檢測方法主要有生物檢測法，免疫分析法，色譜法，色/ 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等。其中微生物檢測法檢測速度快，但靈敏度和準(zhǔn)確度不高，且只能定性檢 測；免疫分析技術(shù)是一種粗篩選方法，雜質(zhì)干擾大的動物源性樣品的檢測結(jié)果會不準(zhǔn)確，且 其難以解決非特異性吸附的問題；薄層色譜法雖然選擇性好，但重復(fù)性差；高效液相色譜 法較為通用，具有高靈敏度和低檢出限等優(yōu)點，但其樣品預(yù)處理時間較長、操作復(fù)雜，不適 宜作為藥物殘留的快速檢測；而色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)綜合了色譜的高分離能力和質(zhì)譜的高定性能 力，但質(zhì)譜儀器較為昂貴，對操作人員的要求也較高，限制其應(yīng)用范圍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速、準(zhǔn)確檢測牛奶中磺胺類 抗菌藥的方法，即管內(nèi)固相微萃取-毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測聯(lián)用技術(shù)。這是一種 利用石墨烯嵌入的多孔聚合物整體柱作為管內(nèi)固相微萃取的固定相對目標(biāo)分析物進(jìn)行高 效富集，并采用高靈敏度、低檢測限的激光誘導(dǎo)熒光檢測器檢測磺胺類抗菌藥的檢測方法。 本方法分離檢測步驟僅需3min，磺胺類抗菌藥的檢測限能達(dá)到20yg/L，實際樣品中定量 濃度可低至3.7yg/L，回收率在91. 1% -93. 8%之間，可以滿足食品樣品的檢測要求。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0006] -種管內(nèi)固相微萃取-毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測聯(lián)用技術(shù)快速檢測牛奶中 磺胺類抗菌藥（磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶）的方法，包括如下步驟：
[0007] S1.待測樣品前處理：
[0008] 準(zhǔn)確量取l-5mL牛奶，加入10-40mmol/L、pH= 3-6的磷酸鹽溶液稀釋至10-50mL， 渦旋混勻，離心，取上清液，再經(jīng)濾膜過濾后備用。取l_5mL上清液至5mL棕色小瓶中備用。
[0009] S2.樣品的管內(nèi)固相微萃?。?br>[0010] 取經(jīng)步驟1處理后的牛奶的上清液1-500UL于一小瓶中，在壓力驅(qū)動下，待測樣 品溶液進(jìn)入萃取柱，目標(biāo)分析物被留在毛細(xì)管內(nèi)的萃取相上，在流出端放置一離心管收集 流過萃取柱的溶液。
[0011] S3.樣品的解析：
[0012] 取5-50yL解析溶劑，在壓力驅(qū)動下，解析溶劑進(jìn)入萃取柱，將萃取柱上的目標(biāo)分 析物洗脫，流出端的離心管收集洗脫下的目標(biāo)分析物。
[0013] S4?樣品的衍生：
[0014] 將收集到的含有目標(biāo)分析物的解析溶劑加入5-50yL乙酸鹽溶液，再加入 0? 2-2yL熒光胺衍生試劑，在20-50°C衍生10_40min。
[0015] S5?樣品的檢測：
[0016] 經(jīng)衍生后的目標(biāo)分析物溶液通過液位差法進(jìn)樣，再經(jīng)毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光 檢測器分離檢測待測樣品中磺胺類抗菌藥，并用外標(biāo)法定量。
[0017] 所述的檢測方法，其中，步驟1中牛奶樣品的過濾使用0. 22ym的Nylon濾膜。
[0018] 所述的檢測方法，其中，步驟1中離心的轉(zhuǎn)速是5000-15000r/min，離心的時間 10_30minD
[0019] 所述的檢測方法，其中，步驟2中所使用的管內(nèi)固相微萃取多孔聚合物整體柱的 制備方法如下：
[0020] 本發(fā)明中石墨烯嵌入的甲基丙烯酸類多孔聚合物整體柱的制備采用光引發(fā)原位 聚合的方法，將含有石墨烯的有機聚合物溶液注入到硅烷化的毛細(xì)管中，在紫外光催化/ 反應(yīng)箱中反應(yīng)10-60min，即可得到所需的整體柱。實驗室制備的有機聚合物溶液由功能單 體、交聯(lián)劑、致孔劑、引發(fā)劑和石墨烯構(gòu)成，其中功能單體為甲基丙烯酸正丁酯，交聯(lián)劑為乙 二醇二甲基丙烯酸酯，致孔劑為N，N-二甲基甲酰胺和聚乙二醇6000,引發(fā)劑為安息香雙 甲醚。實驗中通過改變單體與致孔劑的比例、功能單體和交聯(lián)劑的比例以及致孔劑中兩種 組分的比例來調(diào)節(jié)孔徑和粒徑都符合要求的整體柱，以實現(xiàn)合適的滲透性和比表面積的目 的。選用的毛細(xì)管內(nèi)徑為25-500ym。通過SEM表征有石墨烯的存在以及良好的多孔結(jié)構(gòu)。
[0021] 所述的檢測方法，其中，步驟2中萃取施加的壓力為100-500psi。
[0022] 所述的檢測方法，其中，步驟3中解析施加的壓力為100_500psi。
[0023] 所述的檢測方法，其中，步驟3中解析溶劑是60% -100%甲醇水溶液，百分比為體 積百分比。
[0024] 所述的檢測方法，其中，步驟4中加入乙酸鹽的pH值為2-5。
[0025] 所述的檢測方法，其中，步驟5中分離的毛細(xì)管為25-500ym內(nèi)徑、15-50cm總長 (有效長度l〇-45cm)熔融石英毛細(xì)管。
[0026] 所述的檢測方法，其中，步驟5中采用液位差進(jìn)樣，進(jìn)樣高度為5-lOcm，進(jìn)樣時間 為 5-20s。
[0027] 所述的檢測方法，其中，步驟5中毛細(xì)管電泳分離條件：分離緩沖溶液為 20-100mmol/L、pH= 5-9的磷酸鹽緩沖溶液，分離電場強度為100-500V/cm。
[0028] 本發(fā)明可以獲得如下效果：
[0029] 本發(fā)明提供了一種利用管內(nèi)固相微萃取-毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測聯(lián)用技 術(shù)快速檢測磺胺類抗菌藥的方法，該方法采用管內(nèi)固相微萃取技術(shù)對樣品進(jìn)行前處理，并 采用高靈敏度、低檢測限的激光誘導(dǎo)熒光檢測器檢測。是一種將富集、分離、檢測于一體的 新型綠色環(huán)保的分析方法。
[0030] 本發(fā)明中所述的管內(nèi)固相微萃取柱是通過光聚法制備的石墨烯嵌入的甲基丙烯 酸類多孔聚合物整體柱，石墨烯的加入顯著增加了萃取柱的比表面積和穩(wěn)定性，其與許多 有機物質(zhì)能發(fā)生共軛作用，提高了萃取柱的萃取容量。該萃取柱還具有良好的滲透 性和低傳質(zhì)阻力的特點。其可以實現(xiàn)對復(fù)雜樣品體系中目標(biāo)分析物的快速、高效的富集。
[0031] 利用本發(fā)明中所述的管內(nèi)固相微萃取柱對待測樣品進(jìn)行萃取，得到的解析液經(jīng)衍 生后直接進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離-激光誘導(dǎo)熒光檢測，能夠方便、快捷的檢測出待測樣品中 微量甚至痕量的目標(biāo)分析物。本發(fā)明通過衍生產(chǎn)生熒光進(jìn)行檢測提高靈敏度，減少物質(zhì)干 擾。該方法對牛奶中磺胺類抗菌藥的檢測范圍為20-500yg/L，且線性良好，線性相關(guān)系數(shù) (R2)為0. 9983-0. 9993,檢出限為20yg/L，滿足低殘留量時的檢測要求。
【附圖說明】
[0032] 圖1是本發(fā)明制備的石墨烯嵌入的甲基丙烯酸正丁酯-乙二醇二甲基丙烯酸聚合 物萃取柱的800倍掃描電鏡圖。
[0033] 圖2是本發(fā)明制備的萃取柱的4000倍掃描電鏡圖。
[0034] 圖3是本發(fā)明的萃取裝置示意圖。
[0035] 圖中，1.樣品離心管，2.多孔聚合物萃取柱，3.收集離心管。
[0036] 圖4是100yg/L的三種磺胺類抗菌藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液萃取解析后的電泳譜圖，出峰 順序為磺胺二甲基嘧啶（SMZ) :2. 053min;磺胺甲嘧啶（SMR) :2. 373min;磺胺嘧啶（SDZ): 2. 767min〇
[0037] 圖5是磺胺二甲基嘧啶定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0038] 圖6是磺胺甲基嘧啶定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0039] 圖7是磺胺嘧啶定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0040] 圖8是牛奶樣品萃取解析后與未萃取的電泳譜圖。
【具體實施方式】
[0041] 為了使本技術(shù)領(lǐng)域的人員更好的理解本發(fā)明方案，下面結(jié)合附圖與具體實