一種基于顏色的還原性糖快速檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種物質(zhì)檢測(cè)的方法，特別涉及一種還原性糖的快速檢測(cè)的方法和設(shè)備。
【背景技術(shù)】
[0002]還原性糖是指分子中含有游離醛基或酮基的單糖和含有游離醛基的二和多糖糖，包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、木糖、低聚木糖、麥芽糖、甘露糖、甘露醇、阿拉伯糖。還原性糖的檢測(cè)是生化研宄最重要的基礎(chǔ)操作，因此開發(fā)新型檢測(cè)方法一直是該領(lǐng)域的熱門課題。
[0003]迄今為止，應(yīng)用最早、最廣泛的檢測(cè)方法是銅試劑法。早在1848年Fehling就做出了堿性銅液，即硫酸銅堿性酒石酸鈉溶液，稱為Fehling試劑。還原糖在堿性環(huán)境中將二價(jià)銅離子還原成磚紅色的Cu2O沉淀，進(jìn)而根據(jù)還原價(jià)態(tài)確定還原糖的數(shù)量。到1878年，Soxhlet發(fā)現(xiàn)糖和還原的通量并不是常數(shù)，而是依反應(yīng)時(shí)銅過(guò)量的多少而不同，因此基于銅試劑的方法，需要預(yù)先制定出一個(gè)經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)表。此外，該方法為了使還原糖的還原力達(dá)到最大，反應(yīng)必須在沸水中進(jìn)行，這增加了實(shí)驗(yàn)的不安全性；同時(shí)，Cu2O沉淀需要通過(guò)稱量確定，誤差較大。以上原因?qū)е略摲椒ê馁M(fèi)時(shí)間，準(zhǔn)確度低。
[0004]為了解決以上問(wèn)題，F(xiàn)orsyth于1948年提出了利用苯酚和鹽酸作為展開劑的紙層析法，隨后的20年里，層析法檢測(cè)還原性糖成為了一個(gè)熱點(diǎn)，相繼出現(xiàn)了各種不同的展開劑，包括:三氯乙酸-丁醇、銀氨溶液、苯酚-鹽酸-丁醇等。但該方法操作步驟繁雜，糖在溶劑中容易擴(kuò)散，造成邊緣模糊，且許多物質(zhì)容易混合在一起而無(wú)法分開，導(dǎo)致該法只能用于定性分析而無(wú)法準(zhǔn)確定量。
[0005]出現(xiàn)于1972年水楊酸是第二種廣泛應(yīng)用并延續(xù)至今的化學(xué)方法。與銅試劑法相比，該方法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高等特點(diǎn)；同時(shí)，應(yīng)用范圍廣，可用于多種氧化還原類型的酶促反應(yīng)。其基本原理為3，5-二硝基水楊酸(DNS)在堿性溶液中與還原性糖供熱后被還原成棕色氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原性糖的量與反應(yīng)液的紫外吸光值成正比。然而這種方法在實(shí)際操作中具有明顯的缺點(diǎn)，表現(xiàn)在(I)需用加熱進(jìn)行顯色，步驟冗雜(2)反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)(3)檢測(cè)范圍小，在較高或較低的濃度時(shí)準(zhǔn)確度低(4)無(wú)法進(jìn)行大通量操作。
[0006]最近的30年里，為了提高還原性糖的檢測(cè)精度、簡(jiǎn)化操作工序、探索高通量的操作方案，相繼產(chǎn)生了多種方法，其中較成功的就是氧化還原電極法，包括鉑電極、硫選擇電極、銅選擇電極等。其基本原理為利用氧化銅與還原性糖反應(yīng)導(dǎo)致的溶液氧化還原電勢(shì)變化來(lái)確定還原性糖的濃度。但該方法需要昂貴的電極和復(fù)雜裝配過(guò)程，無(wú)法在實(shí)驗(yàn)室普及。之后，帶有自動(dòng)進(jìn)樣器的高效液相色譜(HPLC)的出現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)了兼顧還原性糖的精確度和高通量操作的目標(biāo)。在HPLC中，還原性糖溶液在不同的時(shí)間被注入色譜柱，通過(guò)壓力在固定相中移動(dòng)，由于被測(cè)物與固定相的相互作用不同，不同的物質(zhì)依次離開色譜柱，通過(guò)檢測(cè)器得到不同的峰信號(hào)，經(jīng)過(guò)分析比對(duì)這些信號(hào)的強(qiáng)弱即可判斷待測(cè)物所含有物質(zhì)的濃度。HPLC具有分離效率高，選擇性好，檢測(cè)靈敏度高，應(yīng)用范圍廣等諸多優(yōu)點(diǎn)。但是分析成本過(guò)高，日常維護(hù)費(fèi)用過(guò)貴，同時(shí)HPLC對(duì)待測(cè)液的預(yù)處理要求嚴(yán)格，待測(cè)樣品一般需要提前稀釋，大大增加了人為誤差，降低了工作效率。此外，還有旋光度法、生物傳感器法等，均由于成本或操作等問(wèn)題，不能應(yīng)用于普通發(fā)酵的大通量檢測(cè)。
[0007]值得注意的是，生化反應(yīng)中常常伴有顏色變化，這些顏色帶有重要的理化信息。遺憾的是，目前為止生化領(lǐng)域?qū)τ陬伾畔⒁恢比鄙儆辛Φ难绣撤椒?。雖然生化研宄一貫將反應(yīng)信息轉(zhuǎn)化為顏色信息，但由于缺少直接分析顏色的方法，該領(lǐng)域人員往往只能利用光透過(guò)有色溶液的光密度值(optical density)信息替代顏色分析，從而產(chǎn)生了很多的誤差和操作的不便捷。本發(fā)明中將計(jì)算機(jī)分析技術(shù)引入生化反應(yīng)研宄，以還原性糖與氧化性指示劑反應(yīng)中的顏色變化作為研宄對(duì)象，嘗試建立新型的高通量還原性糖檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是針對(duì)還原性糖缺乏低成本、高通量、高精度檢測(cè)方法的現(xiàn)狀，提供一套基于顏色分析的快速檢測(cè)方法和設(shè)備，通過(guò)還原性糖與氧化性指示劑所引起的顏色反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色特征進(jìn)行解析，確立顏色信息與還原性糖之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，通過(guò)樣品圖像，即可準(zhǔn)確測(cè)定還原性糖的濃度。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案，通過(guò)下述步驟實(shí)現(xiàn):
[0010]本發(fā)明的裝置基本構(gòu)造如附圖1:
[0011]其裝置包括一個(gè)密閉的箱體(I)，箱體上方裝有攝像頭(2)，箱體后側(cè)面裝有平面燈(3)，箱體正面安裝有工業(yè)平面電腦(4)，箱體底部裝有恒溫加熱器(5)和微孔板載物臺(tái)
(6)，移動(dòng)導(dǎo)軌(7)，密閉箱體(I)的底部被分為兩個(gè)區(qū)域:加熱區(qū)(8)和檢測(cè)區(qū)(攝像頭(2)正下方)。加熱區(qū)的組件為恒溫加熱器(5)，其可以提供0-100°C的恒定反應(yīng)溫度，具體的數(shù)值可在工業(yè)平面電腦(4)上進(jìn)行設(shè)定。
[0012]操作步驟包括:
[0013](I)利用移液槍將適量體積的待測(cè)還原性糖溶液與氧化性顯色劑裝載于微孔板中；
[0014](2)將微孔板置于微孔板載物臺(tái)(6)，由載物臺(tái)傳送軌道(7)傳送至恒溫加熱器
(5)，60-100°C加熱 l-30min ；
[0015](3)加熱后的微孔板由載物臺(tái)傳送軌道(7)傳送至攝像頭(2)下方，由攝像頭(2)進(jìn)行圖像拍攝，記錄各孔道顏色；
[0016](4)工業(yè)平面電腦⑷裝有自動(dòng)分析的軟件，自動(dòng)對(duì)記錄的樣品顏色進(jìn)行解析，并根據(jù)色彩值與還原性糖的對(duì)應(yīng)關(guān)系，快速準(zhǔn)確地確定還原性糖的濃度，并生成報(bào)告。
[0017]本發(fā)明所述的還原性糖是指分子中含有游離醛基或酮基的單糖、含有游離醛基的二糖和多糖，包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、木糖、低聚木糖、麥芽糖、甘露糖、甘露醇、阿拉伯糖、纖維二糖；所述的氧化性指示劑是指自身具有氧化性、被還原后發(fā)生顏色變化的指示劑，包括氧化銅、銀氨溶液、3，5- 二硝基水楊酸、斐林試劑；顏色的色彩值包括顏色值、色調(diào)、亮度、飽和度。
[0018]本發(fā)明的有益效果:①高效率。該方法可在30min內(nèi)完成1000個(gè)樣品的檢測(cè)，速度是高效液相色譜的200倍。②高量程。該方法的檢測(cè)量程為0-20g/L，是標(biāo)準(zhǔn)3，5- 二硝基水楊酸法的20倍。③操作簡(jiǎn)單。該方法不需要水浴加熱等復(fù)雜操作步驟，保證了工作效率，便于自動(dòng)化儀器的搭建。④成本低。該方法檢測(cè)100個(gè)樣品的是標(biāo)準(zhǔn)DNS法消耗的酒石酸鈉、3，5- 二硝基水楊酸的8.5%。
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1，快速檢測(cè)裝置正面圖
[0020]圖2，快速檢測(cè)裝置側(cè)視圖(側(cè)面俯視圖)
[0021]圖3，快速檢測(cè)裝置工作區(qū)域指示圖
[0022]圖面說(shuō)明如下:
[0023]I箱體，2攝像頭，3平面燈，4工業(yè)平面電腦，5恒溫加熱器，6微孔板載物臺(tái)，7載物臺(tái)傳送軌道，8加熱區(qū)，9圖像采集區(qū)。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0025]實(shí)施例1
[0026]用移液槍吸取170 μ L已知濃度的葡萄糖0.5g/L, 2.5g/L, 7.5g/L, 12g/L, 16g/L樣品于96微孔板中后，各孔道加入170 μ L 10g/L 3，5- 二硝基水楊酸溶液，100°C反應(yīng)4分鐘后，以反應(yīng)溶液的顏色在RGB顏色空間中的R值對(duì)各樣品濃度進(jìn)行預(yù)測(cè)，各樣品分別檢測(cè)100 次，使用時(shí)間為 6min，平均值分別為 0.48g/L, 2.52g/L, 7.35g/L, 11.68g/L, 16.12g/L，最大誤差分別為 3.31%,3.36%,4.25%,3.38%,4.41%。
[0027]實(shí)施例2
[0028]用移液槍吸取170 μ L已知濃度的木糖0.5g/L, 2.5g/L, 7.5g/L, 10g/L, 18g/L樣品于96微孔板中后，各孔道加入170 μ L 10g/L 3，5-二硝基水楊酸溶液，90°C反應(yīng)5分鐘后，以反應(yīng)溶液的顏色在RGB顏色空間中的R值對(duì)各