食用油過(guò)氧化值酶生物傳感器的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體是食用油過(guò)氧化值酶生物傳感器的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 油脂在加工、貯藏、流通、使用等過(guò)程中，由于光、熱和空氣中的氧等作用常會(huì)發(fā)生 酸敗變質(zhì)的復(fù)雜變化。一般油脂尤其是富含不飽和脂肪酸的植物油在空氣中氧的作用下會(huì) 氧化酸敗，在氧化過(guò)程中生成過(guò)氧化物和氫過(guò)氧化物等中間產(chǎn)物，它們很容易分解而產(chǎn)生 揮發(fā)性和非揮發(fā)性脂肪酸、醛、酮和醇等，這些酸敗產(chǎn)物常具有特殊的臭氣和苦澀滋味，大 大影響油脂的感官性質(zhì)，并且造成其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值大大下降。油脂中的脂質(zhì)過(guò)氧化物的含量是 以每千克油脂中活性氧的毫克當(dāng)量即過(guò)氧化值來(lái)表示的，過(guò)氧化值是判斷油脂新鮮程度和 質(zhì)量等級(jí)的重要標(biāo)準(zhǔn)。
[0003] 食用油過(guò)氧化值的檢測(cè)是確保油品質(zhì)量的關(guān)鍵手段，國(guó)內(nèi)外廣泛使用的測(cè)定方法 主要有高效液相色譜法和化學(xué)滴定法。高效液相色譜法需使用大型儀器，實(shí)際成本高，難以 作為普查使用；而化學(xué)滴定法的反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，步驟繁瑣，試劑需提前一周以上時(shí)間配制，全 部手工操作，易受操作人員的人為因素干擾。碘量法（CB/T5538)是油脂過(guò)氧化值國(guó)際通用 的分析方法，簡(jiǎn)單易行，在普通化驗(yàn)室里就可以進(jìn)行，但碘量法測(cè)定過(guò)程易受多種外界因素 的影響，如溶液的PH值、溫度、加水量及搖動(dòng)速度、滴定終點(diǎn)的判斷等因素，使其測(cè)定值的 波動(dòng)性大，重復(fù)性差，所以造成該法靈敏度低，同時(shí)存在取樣量大，難以適應(yīng)于現(xiàn)代社會(huì)所 提出的精確、快速、便攜、現(xiàn)場(chǎng)化的食品安全檢測(cè)理念。
[0004] 目前我國(guó)各防疫部門(mén)檢測(cè)食用油過(guò)氧化值都按照GB/T5009. 37-1996規(guī)定的分 析方法（化學(xué)滴定法）。國(guó)內(nèi)外相繼發(fā)表了檢測(cè)過(guò)氧化值的發(fā)明文獻(xiàn)專(zhuān)利，如中國(guó)專(zhuān)利 (CN87106131. 7) "過(guò)氧乙酸測(cè)定試紙及其制備方法"涉及用試紙測(cè)定水溶性消毒液中的過(guò) 氧乙酸的含量；日本專(zhuān)利（53-30383) "油脂中過(guò)氧化物測(cè)定試紙的制備方法"是以可溶性 淀粉、碘化鉀作為主要成分，都具有如下缺陷：對(duì)光和氧敏感，易失效；反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，超過(guò)5 分鐘；只能定性和半定量測(cè)量，不能測(cè)出準(zhǔn)確的數(shù)值等。目前尚未見(jiàn)到有關(guān)采用絲網(wǎng)印刷技 術(shù)產(chǎn)業(yè)化制作一次性用于食用油過(guò)氧化值檢測(cè)酶電極的相關(guān)報(bào)道。
[0005] 經(jīng)對(duì)現(xiàn)在技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?3132054. 6名稱(chēng)為"一種制備二 氧化鈦凝膠膜電化學(xué)生物傳感器的方法"，該專(zhuān)利中采用二氧化鈦凝膠膜對(duì)傳統(tǒng)電極進(jìn)行 修飾，然后采用電化學(xué)的方法來(lái)檢測(cè)過(guò)氧化氫。該方法制備修飾電極的過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜，電極 的準(zhǔn)備時(shí)間超過(guò)2小時(shí)，制備出的修飾電極穩(wěn)定性差，修飾電極不能長(zhǎng)期保存，當(dāng)保存時(shí)間 超過(guò)一個(gè)月，電極的響應(yīng)靈敏度下降超過(guò)25%，因而不能大范圍推廣使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種食用油過(guò)氧化值的酶生 物傳感器的制備方法，使其易于產(chǎn)業(yè)化制作和一次性使用，并且大大縮短了樣品處理和檢 測(cè)時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)樣品的現(xiàn)場(chǎng)、快速、精確檢測(cè)。
[0007] 本發(fā)明的原理如下：
[0008] 油脂屬于低導(dǎo)電或非導(dǎo)電的、疏水性的物質(zhì)，因此研宄測(cè)定油脂的過(guò)氧化物成分， 就是在有機(jī)相中測(cè)定有機(jī)過(guò)氧化物，就需要制備有機(jī)相過(guò)氧化物酶電極。本發(fā)明利用殼聚 糖良好的成膜性和較好的粘結(jié)能力以及其內(nèi)部的極性化學(xué)基團(tuán)，將辣根過(guò)氧化物酶（HRP) 固定在酶生物傳感器檢測(cè)電極中工作電極的表面，制成能夠?qū)κ秤糜瓦^(guò)氧化值進(jìn)行快速檢 測(cè)的電流型生物傳感器，食用油中的過(guò)氧化物與酶底物在HRP的催化作用下發(fā)生氧化還原 反應(yīng)，產(chǎn)生電子迀移，形成電流，電流強(qiáng)度與過(guò)氧化物濃度成正比，檢測(cè)范圍為lmeq/kg? 60meq/kg〇
[0009] 在于電極連線與對(duì)電極連成一體組成另一條電極基片，兩條電極基本相互平行， 電極連線表面上涂覆一層聚碳酸酯絕緣體，兩條電極基本設(shè)置在電極基片上，接線端子和 對(duì)電極均為裸露的導(dǎo)電材料薄膜，在相互平行的對(duì)電極和工作電極兩端覆蓋有隔離片，隔 離片與對(duì)電極、工作電極垂直放置，隔離片上部覆蓋蓋片，電極、隔離片和蓋片之間的空隙 形成加樣孔。本發(fā)明涉及一種應(yīng)用絲網(wǎng)印刷電極檢測(cè)食用油過(guò)氧化值的酶生物傳感器的制 備方法，包括如下步驟：
[0010] 步驟一，在酶生物傳感器檢測(cè)電極的工作電極上采用絲網(wǎng)印刷法印刷一層殼聚糖 膜，晾干后在電極的工作電極上印刷辣根過(guò)氧化物酶、緩沖溶液、膨脹劑、酶保護(hù)劑的混合 漿液，50°C干燥；辣根過(guò)氧化物酶的濃度為0. 5?6. 5mg/mL。使用絲網(wǎng)印刷機(jī)，使酶膜的厚 度達(dá)到1?4ym。
[0011] 步驟二，將上述烘干的電極板再次印刷含有酶底物3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺、反應(yīng) 促進(jìn)劑噻挫、表面活性劑0P-10、膨脹劑等的混合漿液，50°C干燥，粘貼上隔離片，然后蓋上 蓋片，在10-25°C環(huán)境下保存酶生物傳感檢測(cè)電極；所述表面活性劑可選用十二烷基硫酸 鈉或0P-10或吐溫20。反應(yīng)促進(jìn)劑是苯并噻唑的衍生物，分子結(jié)構(gòu)為：R3C6HmN:C(R4)S;其 中m= 3-4 ;R3=H，CH3,C2H5;R4=H，OH，SH，NH2。酶底物是聯(lián)苯胺的衍生物，分子式為： [1^孔順2] 2;其中m= 2-4,Ri=H，CH3,C6H5,CH30,NH2;R2=H，CH3。
[0012] 步驟三，將待測(cè)的食用油樣品與萃取液等體積混合形成反應(yīng)液，并將生成的反應(yīng) 液滴加到酶生物傳感器檢測(cè)電極的加樣孔中；萃取試劑為選自30?70% (w/w)的甲醇水 溶液、乙醇水溶液、異丙醇水溶液和葵醇水溶液中的一種或兩種以上的組合。
[0013] 步驟四，檢測(cè)工作電極與對(duì)電極之間的電流，若電流在電流檢測(cè)儀的檢測(cè)范圍之 內(nèi)，則可通過(guò)電流檢測(cè)儀自動(dòng)處理轉(zhuǎn)化，并與單片機(jī)中儲(chǔ)存的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)，轉(zhuǎn)化為過(guò) 氧化值的濃度，直接由顯示器顯示出檢測(cè)結(jié)果，若電流低于或高于電流檢測(cè)儀的檢測(cè)范圍， 則顯示器顯示過(guò)氧化值的濃度低于檢測(cè)范圍的最小值或高于檢測(cè)范圍的最大值；所述電流 檢測(cè)儀的檢測(cè)范圍為lmeq/kg-60meq/kg。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果：
[0015] 1、本發(fā)明具有絲網(wǎng)印刷電極結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，加工方法簡(jiǎn)便、成本低，用該絲網(wǎng)印刷電極 制成的傳感器檢測(cè)過(guò)氧化值操作方便，樣品前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，只需5秒，抗干擾能 力強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度高。而且酶電極電化學(xué)分析法中修飾電極由于可以固定化和修飾電活性 物質(zhì)，有效地提高了其選擇性、可以有效消除其他物質(zhì)的干擾。
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