r>[0035] 所述的固相萃取柱體積為3mL，篩板為聚丙烯篩板，篩板的孔徑為20微米。
[0036] 所述的注射器為醫(yī)用5mL注射器。
[0037] 所述的石英砂為100目石英砂。
[0038] 所述的固相萃取小柱轉(zhuǎn)接頭為月旭科技(上海）股份有限公司購買。
[0039] 鹽酸克倫特羅仿生抗體制備 通過共價法制備鹽酸克倫特羅仿生抗體，具體步驟為：取1mmolCLB衍生物置于圓底 燒瓶中，然后加入5ml甲醇-乙酸乙酯混合溶液（3:2,V:V)中，待全部溶解后，加入2mmol 交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯、30mg引發(fā)劑偶氮二異丁腈，待固體全部溶解后，氮吹5min 除氧，然后密封圓底燒瓶，將其置于70 °C水浴條件下聚合48h。聚合反應(yīng)結(jié)束后，用研缽 將聚合物仿生抗體研至顆粒狀，然后置于真空干燥箱中45 °C干燥過夜。將干燥后的lg聚 合物仿生抗體用200mL鹽酸（3mol/L)與甲醇的混合溶液（10:1，V:V)超聲洗脫72h，然 后再用甲醇-冰乙酸混合溶液（9:1，V:V)索氏提取鹽酸克倫特羅分子，直至無鹽酸克倫特 羅檢出為止。洗脫完畢后的聚合物仿生抗體在真空干燥箱中干燥后備用。
[0040]鹽酸克倫特羅衍生物的制備 取10mmol鹽酸克倫特羅溶于50mL二氯甲烷中，向溶液中加入40mmol三乙胺后，滴 加20mmol甲基丙烯酰氯，室溫反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，分出有 機相后，水相用二氯甲烷重復(fù)洗2次后，合并分離出的所有有機相，用無水硫酸鈉干燥后， 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓去除有機溶劑，殘余物以石油醚-乙酸乙酯（3:1，V:V)為淋洗液用硅膠 柱(硅膠直徑為200~300目）提純后得到產(chǎn)物CLB衍生物。
[0041] 測試層制備 將10mg鹽酸克倫特羅仿生抗體與0.2g石英砂混合均勻后裝入固相萃取柱。
[0042] 酶標(biāo)探針制備 采用EDC法制備鹽酸克倫特羅-辣根過氧化物酶酶標(biāo)探針。
[0043] 檢測限確定 (1)活化：取制備好的仿生免疫柱，用1mLpH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液對柱進行活化。
[0044] (2)上樣：用移液器將lmL不同濃度的鹽酸克倫特羅甲醇溶液（0、10、100、1000 yg/L)注入固相萃取柱，然后通過固相萃取小柱轉(zhuǎn)接頭連接注射器和固相萃取柱，推動注 射器的活塞柄，通過空氣壓力將樣品溶液固定于測試層，保持3分鐘。時間結(jié)束后將樣品溶 液排出固相萃取柱。
[0045] (3)洗柱：用lmL含有0? 5% (體積百分?jǐn)?shù)）吐溫20的PBS洗滌測試層。
[0046] (4)加入酶標(biāo)探針：加入lmL辣根過氧化物酶標(biāo)記的鹽酸克倫特羅PBS溶液 (1:2000,體積比）于測試層，并保持4分鐘，然后通過注射器將其排出固相萃取柱。
[0047] (5)洗柱：用lmLX4 (洗柱4次）的含有0? 5% (體積百分?jǐn)?shù)）吐溫20的PBS洗柱。
[0048] (6)顯色：加入400yLTMB單成分顯色劑于測試層，保持4分鐘后觀察顏色深淺， 4-5分鐘判斷結(jié)果，超過7分鐘，結(jié)果無效。
[0049] 根據(jù)測試層顏色深淺判斷上樣溶劑中鹽酸克倫特羅的含量，測試層顏色越淺表明 上樣溶液中鹽酸克倫特羅的濃度越高。結(jié)果(見參考圖片）為，當(dāng)鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品濃度 為10yg/L時，測試層有顏色，呈陰性；當(dāng)鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品濃度為100、1000yg/L時，測 試層沒有顏色，顯陽性，表明本鹽酸克倫特羅仿生免疫檢測柱對鹽酸克倫特羅的檢測限為 100yg/L〇
[0050] 特異性試驗 用制備的仿生免疫檢測柱檢測100yg/L和1000yg/L的鹽酸克倫特羅及結(jié)構(gòu)類似 物特布他林、異丙腎上腺素、沙丁胺醇，結(jié)果見表1。
【主權(quán)項】
1. 鹽酸克倫特羅仿生免疫柱，其特征在于：包括固相萃取柱（1)、測試層（2)、篩板、固 相萃取小柱轉(zhuǎn)接頭（5)和注射器（6);固相萃取柱（1)與注射器（6)通過固相萃取小柱轉(zhuǎn)接 頭（5)連接，篩板分為上篩板（3)和下篩板（4)，固相萃取柱（1)內(nèi)部為測試層（2)，測試層 (2)的頂端裝有上篩板（3)，底端裝有下篩板（4);測試層（2)為鹽酸克倫特羅仿生抗體和石 英砂的均勻混合物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽酸克倫特羅仿生免疫柱，其特征在于：固相萃取柱（1)的 體積為3mL ;篩板為聚丙締篩板，篩板的孔徑為20微米。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽酸克倫特羅仿生免疫柱，其特征在于：石英砂為100目。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽酸克倫特羅仿生免疫柱，其特征在于：鹽酸克倫特羅仿生 抗體為通過分子印跡技術(shù)制備的分子印跡聚合物，所述分子印跡技術(shù)為共價鍵聚合技術(shù)或 非共價鍵聚合技術(shù)。
5. -種如權(quán)利要求1所述鹽酸克倫特羅仿生免疫柱的檢測方法，其特征在于；該方法 步驟如下： (1) 活化；磯酸鹽緩沖液（PBS)活化； (2) 上樣；將鹽酸克倫特羅溶液或樣品溶液用移液器注入固相萃取柱，利用注射器的空 氣壓力將樣品溶液壓到測試層； (3) 洗柱；用含有吐溫的PBS溶液洗柱； (4) 加入酶標(biāo)探針； (5) 洗柱；用含有吐溫的PBS溶液洗柱； (6) 顯色；加入TMB單成分顯色劑顯色，最后根據(jù)測試層顏色深淺判斷溶液中鹽酸克倫 特羅的濃度，顏色越淺，表明樣品中鹽酸克倫特羅的含量越多。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的鹽酸克倫特羅仿生免疫柱的檢測方法，其特征在于：步驟 (1) 活化時所用的PBS的抑值為7. 4,活化所用的體積為ImL。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的鹽酸克倫特羅仿生免疫柱的檢測方法，其特征在于：步驟 (2) 中上樣用鹽酸克倫特羅溶液為甲醇溶液，體積為ImU吸附時間為3分鐘。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的鹽酸克倫特羅仿生免疫柱的檢測方法，其特征在于：步驟 (3) 中洗柱用的PBS溶液含有體積百分比0. 5%的吐溫20,用量為1血。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的鹽酸克倫特羅仿生免疫柱的檢測方法，其特征在于：步驟 (4) 加入的酶標(biāo)探針為鹽酸克倫特羅辣根過氧化物酶標(biāo)記物，用量為ImL 2000倍稀釋的 PBS，吸附時間為4分鐘。
10. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的鹽酸克倫特羅仿生免疫柱的檢測方法，其特征在于：步驟 (5) 所用PBS為含有體積百分比0. 5%的吐溫20,用量為4mL ;步驟（6)TMB單成分顯色劑的 用量為400 y以顯色時間為4分鐘。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鹽酸克倫特羅仿生免疫柱及其檢測方法，該仿生免疫柱包括固相萃取柱、測試層、篩板、固相萃取小柱轉(zhuǎn)接頭和注射器；其檢測步驟是：活化，上樣，洗柱，加入酶標(biāo)記物，洗柱，顯色。根據(jù)測試層的顏色深淺定性或半定量樣品中的鹽酸克倫特羅含量。該仿生免疫柱制備簡單、操作方便、成本低廉、特異性好、不需要專業(yè)培訓(xùn)，檢測結(jié)果清晰易辨別，易于推廣，適宜現(xiàn)場檢測。
【IPC分類】G01N33-535
【公開號】CN104535759
【申請?zhí)枴緾N201510029262
【發(fā)明人】湯軼偉, 高子媛, 勵建榮, 閆俊宇, 蘭建興, 魏立巧, 李譯, 高靜紋
【申請人】渤海大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2015年1月21日